吳雪琴，徐剛標(biāo)，梁 艷，王家慶

觀光木ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

吳雪琴1，徐剛標(biāo)1，梁 艷1，王家慶2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.韶關(guān)國(guó)有河口林場(chǎng)，廣東 韶關(guān) 512532 )

利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)影響觀光木ISSR-PCR擴(kuò)增的主要因素(模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+的濃度，TaqDNA聚合酶的用量以及退火溫度)進(jìn)行優(yōu)化， 建立觀光木ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系。結(jié)果表明:最佳反應(yīng)體系(20 μL)為:模板DNA 50 ng，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，MgCl22.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃ 保存。該反應(yīng)體系的建立，為觀光木遺傳多樣性分析提供了客觀可靠的方法。

觀光木；正交優(yōu)化； ISSR-PCR；遺傳多樣性

觀光木Tsoongiodendron odorum Chun為木蘭科觀光木屬常綠大喬木，是單種屬古老孑遺樹種，是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[1]，對(duì)研究古代植物區(qū)系、古地理、古氣候都有重要的科學(xué)價(jià)值[2]。該種分布區(qū)很廣，湖南、江西南部、福建、廣東、廣西、云南東部、海南等地均有零星分布，其中，以南嶺山地種群數(shù)量相對(duì)較多。近年來(lái)，觀光木研究主要集中在生物學(xué)特性、育苗造林技術(shù)、生態(tài)學(xué)特性等方面[3]，僅見黃久香等[4-5]采用RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)研究觀光木遺傳多樣性報(bào)道，但種群數(shù)量少，研究結(jié)果難以代表整個(gè)物種的變異水平。

基于PCR技術(shù)的ISSR( inter simple sequence repeat)標(biāo)記已成功地應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，與RAPD標(biāo)記相比，ISSR比RAPD重復(fù)性好[6]。為了建立觀光木ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，本研究利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)影響觀光木ISSR-PCR擴(kuò)增的重要因素進(jìn)行優(yōu)化，旨在為采用ISSR標(biāo)記研究觀光木種群遺傳多樣性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料于2011年4月底采集于貴州省黎平縣。采回的觀光木新鮮葉片置于-70 ℃冰箱中保存。參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）2006年公布的ISSR引物序列，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。經(jīng)初步篩選出的854號(hào)引物，即(TC)8RG作為此次反應(yīng)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的固定引物。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

觀光木葉片基因組DNA提取，采用改良的CTAB法及參考文獻(xiàn)[4-8]并略作改動(dòng)。用Eppendorf公司的Biophotometer核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA含量和純度，用0.8﹪瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總DNA質(zhì)量，用G-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA是否污染并拍照記錄。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增

以提取的觀光木 DNA樣品為模板，進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]:94 ℃預(yù)變性 5 min，接著進(jìn)行 35個(gè)循環(huán):94 ℃變性 1 min，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。

反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中包括1×PCR Buffer，其它成分(模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物、TaqDNA聚合酶)按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)所分析的濃度加入，不足20 μL用超純水補(bǔ)足。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增體系的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和ISSR-PCR擴(kuò)增效果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)模板DNA，Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物等 5個(gè)主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化篩選，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(模板DNA10～60 ng、Taq DNA聚合酶0.5～1.75 U、Mg2+1.0～3.5 mmol/L、dNTPs 0.1～0.35 mmol/L、引物0.1～0.6 μmol/L)，分別設(shè)置6個(gè)梯度，以基本擴(kuò)增體系為基礎(chǔ)，每次改變一個(gè)因素，以確定該因素對(duì)ISSR結(jié)果的影響。

1.2.4 ISSR-PCR擴(kuò)增體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，最終確定ISSR-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系。

1.2.5 ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，緩沖液1×TAE，電壓5 V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距離前沿約2～3 cm時(shí)停止電泳，用G-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度與濃度

將提取的基因組 DNA稀釋 100倍，在UnicoTM UV-2102PC型紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)260 nm和 280 nm的吸光值，計(jì)算所提取 DNA的純度和濃度。結(jié)果如表1所示，所提取的DNA的OD260nm/OD280nm值在1.6和2.0之間，濃度和純度都符合ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求[8]。

表1 DNA的紫外檢測(cè)結(jié)果Table 1 The ultraviolet absorption test of DNA

2.2 模板DNA用量對(duì)ISSR- PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

20 μL PCR反應(yīng)體系，設(shè)定6個(gè)模板DNA濃度 (ng/20 μL)梯度 (10、20、30、40、50、60)，擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果(如圖1)表明:在其它條件一致的情況下，DNA模板量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響較小，模板DNA在10～60 ng內(nèi)均能擴(kuò)增出條帶。在濃度低于和等于40 ng時(shí)，擴(kuò)增的條帶亮度相對(duì)較低，清晰度不高且條帶較少。模板濃度50 ng與60 ng相比，50 ng/20 μL擴(kuò)增出的條帶清晰明亮，多態(tài)性最高。因此適宜的模板DNA濃度為 50 ng/20 μL。

圖1 不同模板 DNA濃度對(duì)ISSR-PCR的影響Fig 1 Effects of different template concentrations on ISSR-PCR

2.3 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

Taq DNA聚合酶的用量對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)起著決定性的影響作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了 6個(gè)Taq DNA聚合酶濃度(U)梯度 (0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75)，結(jié)果(見圖2)表明：在 20 μL反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶在6個(gè)遞度范圍內(nèi)均得到清晰的擴(kuò)增條帶，酶濃度在 1.25U時(shí)擴(kuò)增得到的條帶最多，因此適宜的 Taq DNA聚合酶濃度為 1.25 U/20 μL。

圖2 不同 Taq DNA聚合酶濃度對(duì) ISSR-PCR的影響Fig.2 Effects of different Taq DNA polymerase concentrations on ISSR-PCR

2.4 Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活劑，酶對(duì) Mg2+的濃度非常敏感，其濃度將直接影響Taq酶的活性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了6個(gè)Mg2+濃度(mmol/L)梯度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5)，由擴(kuò)增結(jié)果(如圖 3)可知：在不同濃度下擴(kuò)增出多態(tài)性條帶有明顯差異，濃度在2.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶最多且清晰明亮；濃度大于2.0 mmol/L或小于2.0 mmol/L時(shí)，均有部分條帶缺失，因此選擇適宜的Mg2+濃度為 2.0 mmol/L。

圖3 不同 Mg2+濃度對(duì) ISSR-PCR的影響Fig.3 Effects of different Mg2+ concentrations on ISSR-PCR

2.5 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

dNTPs是PCR反應(yīng)的原料，其濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6個(gè)濃度(mmol/L)梯度 (0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35)，擴(kuò)增結(jié)果(如圖4 )表明:在不同濃度下，擴(kuò)增的結(jié)果有較大差異。濃度越高的擴(kuò)增出的條帶越不清晰，濃度過(guò)低的擴(kuò)增的條帶也不理想，濃度為0.20 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶相對(duì)較多且清晰。因此選擇適宜的dNTPs反應(yīng)濃度為0.20 mmol/L。

圖4 不同 dNTPs濃度對(duì) ISSR-PCR的影響Fig.4 Effects of different dNTPs’s concentrations on ISSR-PCR

2.6 引物濃度對(duì) ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

引物用量對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6個(gè)引物濃度(μmol/L)梯度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6)， 擴(kuò) 增 結(jié) 果 (見圖5)表明:不同的引物濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有較大的影響，濃度越低擴(kuò)增條帶越不清晰，且有部分條帶缺失，濃度在0.4～0.6 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增效率逐漸增高，條帶較清晰，引物濃度為0.6 μmol/L時(shí)，條帶相對(duì)最多最清晰，因此適宜的引物濃度為 0.6 μmol/L。

圖5 不同Primer濃度對(duì) ISSR-PCR的影響Fig.5 Effects of different primer concentrations on ISSR-PCR

2.7 ISSR-PCR正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照正交試驗(yàn)表L18(35)設(shè)計(jì)5因素3水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系，結(jié)果如圖6所示。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驍U(kuò)增出較清晰的條帶。在18個(gè)處理組中，第8組設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擴(kuò)增的效果最好，譜帶最多而且清晰明亮，多態(tài)性高。

圖6 ISSR-PCR正交設(shè)計(jì)電泳圖譜Fig.6 Band patterns of orthogonal design of optimal ISSRPCR system

2.8 退火溫度對(duì)ISSR-PCR的影響

不同的引物有不同的退火溫度，引物UBC854以其Tm(Tm:56)值為中心，設(shè)置6個(gè)退火溫度梯度(53、54、55、56、57、58 ℃)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由結(jié)果(如圖 8)得出，引物UBC854在55 ℃時(shí)，擴(kuò)增出的條帶多而亮，而低于或者高于 55 ℃，擴(kuò)增的條帶相對(duì)較少且亮度淺。因此，退火溫度的高低也直接影響著擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，觀光木ISSR反應(yīng)體系中引物UBC854最適宜的退火溫度為 55 ℃。

圖7 不同退火溫度對(duì) ISSR-PCR的影響Fig.7 Effects of different annealing temperatures on ISSR-PCR

2.9 最優(yōu)體系的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證優(yōu)化后的體系，選取觀光木的另外13個(gè)樣品所提取的DNA采用L18(35)中第8組設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示。從圖8可知:條帶的多態(tài)性與清晰度好，說(shuō)明該體系能很好地滿足觀光木的ISSR遺傳多樣性研究。

圖8 其他13個(gè)樣品擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 Electrophoresis of PCR products of all 13 plant materials

3 結(jié) 論

ISSR擴(kuò)增受模板、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物等因素影響，退火溫度的高低也直接影響著擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，不同引物的最適退火溫度不同。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響觀光木ISSR-PCR擴(kuò)增的重要因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了觀光木ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系(20 μL):模板DNA 50 ng、 TaqDNA聚合酶1.25 U、MgCl22.5 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.4 μmol/L。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃ 保存。該反應(yīng)體系的建立為觀光木種質(zhì)資源分類、遺傳多樣性分析以及分子譜系地理學(xué)研究提供了更客觀可靠的方法。

[1] 傅立國(guó),金鑒明.中國(guó)植物紅皮書— —稀有瀕危植物:第一冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1992:454-455.

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Establishment and optimization of Tsoongiodendron odorum ISSR-PCR reaction system

WU Xue-qin1，XU Gang-biao1，LIANG Yan1, WANG Jia-qing2
(1.School of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China;2. State-owned Hekou Forest Farm, Shaoguang 512532, Guangdong, China)

Through the orthogonal design experiments, the important factors of the inter-simple sequence repeat PCR (ISSR-PCR)amplification system, such as DNA template，primers，dNTPs，Mg2+concentration，dose of TaqDNA polymerase and annealing temperature fit for Tsoongiodendron odorum were optimized. The results show that the optimal reaction system by the volume of 20 μL was established as follows: 50 ng DNA template，0.4 μmol/L primers，0.25 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/LMgCl2，1.25 U Taq DNA polymerase. The PCR procedure was: pre-denaturing at 94 ℃ for 5 minutes，35 cycles of denaturation at 94 ℃ for 1 minute，annealing at 55 ℃ for 30 seconds and extension at 72 ℃ for 90 seconds，with 7 minutes final extension at 72 ℃ and then stored at 4 ℃ .The orthogonal-based ISSR-PCR reaction system provided a reliable method for genetic diversity analysis in Tsoongiodendron odorum.

Tsoongiodendron odorum；orthogonal design；ISSR-PCR; genetic diversity

S718.46

A

1673-923X (2012)07-0076-04

2012-03-14

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201104033)

吳雪琴(1987—)，女，四川樂(lè)山人，碩士研究生；主要從事分子種群遺傳學(xué)研究

徐剛標(biāo)(1965—)，男，安徽樅陽(yáng)人，教授，博士；主要從事森林遺傳學(xué)及林業(yè)生物技術(shù)研究

[本文編校：吳 毅 ]