沙 漠 逄煥明 古麗娜孜 李 靜 殷 勇 楊海燕
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)
自然發(fā)酵辣椒醬中乳酸菌的分離與鑒定
沙 漠 逄煥明 古麗娜孜 李 靜 殷 勇 楊海燕
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)
從自然發(fā)酵的辣椒醬中分離出產(chǎn)酸量高、生長(zhǎng)良好的菌株,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性及發(fā)酵性能試驗(yàn),最終選定Lact.1和Lact.2兩株適用于發(fā)酵辣椒試驗(yàn)的乳酸菌。鑒定結(jié)果表明Lact.1為植物乳酸桿菌 (Lactobacillus planetarium),Lact.2 為 腸 膜 明 串 珠 菌 (Leuconostoc mesenteroides)。試驗(yàn)結(jié)果表明兩株乳酸菌產(chǎn)酸速度快,最適生長(zhǎng)溫度在30℃到40℃之間,最適生長(zhǎng)p H 6.0,當(dāng)食鹽濃度在7%以下能生長(zhǎng)。
發(fā)酵辣椒;乳酸菌;分離鑒定
目前,市面銷(xiāo)售的辣椒制品主要有辣椒醬、辣椒粉及干辣椒等傳統(tǒng)粗加工制品方面,而發(fā)酵型辣椒醬在銷(xiāo)售中又占有相對(duì)較大的比重[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒醬生產(chǎn),主要利用辣椒醬中存在的天然乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)生乳酸,再在辣椒醬中加入一定量的食鹽,食鹽的高滲透作用使得辣椒醬中大部分雜菌的生長(zhǎng)受到抑制,從而發(fā)酵制成辣椒醬[2]。其獨(dú)特的風(fēng)味深受人們的喜愛(ài)[3,4]。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒醬普遍存在著一些問(wèn)題:食鹽的含量過(guò)高(過(guò)多的食用食鹽會(huì)造成某些器官如腎脈、心血管系統(tǒng)的永久性損傷[5]),質(zhì)量不穩(wěn)定,在保藏和使用的過(guò)程中質(zhì)構(gòu)易軟化、表面易“生花”等[6,7]。
乳酸菌發(fā)酵食品是一種國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者所喜愛(ài)的營(yíng)養(yǎng)保健食品[8,9]。發(fā)酵蔬菜用的生產(chǎn)菌株主要是乳酸菌,篩選出專(zhuān)用于發(fā)酵辣椒的乳酸菌種對(duì)于在發(fā)酵辣椒醬生產(chǎn)中縮短生產(chǎn)周期、提高食品安全性和穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量起著關(guān)鍵性的作用[10,11]。為此,本試驗(yàn)從自然發(fā)酵的辣椒醬中篩選出發(fā)酵辣椒專(zhuān)用乳酸菌株,并對(duì)菌株進(jìn)行了生產(chǎn)性能的測(cè)試和鑒定,意在實(shí)現(xiàn)發(fā)酵辣椒的安全化、工業(yè)化生產(chǎn)。
辣椒:新疆輕工國(guó)際投資有限公司。
蛋白胨,牛肉膏,酵母提取物,乙酸鈉,葡萄糖,K2HPO4,瓊脂,檸檬酸二銨,吐溫80,硫酸鎂,碳酸鈣等:均為分析純。
乳酸菌富集培養(yǎng)基[9]:牛肉膏1%、蛋白胨1%、葡萄糖5%、酵母膏0.5%、溴甲基酚紫0.04%、K2HPO40.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、吐溫80 0.1%,瓊脂1.5%、p H 6.6,121℃滅菌30 min。用作乳酸菌的初步富集。
乳酸菌分離培養(yǎng)基[9]:碳酸鈣單獨(dú)滅菌后,在葡萄糖2%的MRS的固體培養(yǎng)基滅菌后溫度降至45℃左右時(shí),再加入碳酸鈣,并充分震蕩混勻。用作乳酸菌的分離使用。
乳酸菌斜面保存培養(yǎng)基[9]:葡萄糖2% 的 MRS固體培養(yǎng)基。
精密p H計(jì):PHS-3C型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子顯微鏡:XS-18型,江南光學(xué)儀器廠;
生物安全柜:HR40-ⅡA2型,青島海爾特種電器有限公司;
滅菌鍋:LD2X-40BI型,上海申安醫(yī)療器械廠;
電子恒溫培養(yǎng)箱:DPH-9162型,上海一恒科技有限公司;
數(shù)顯恒溫水浴鍋:HH-S型,金壇市醫(yī)療器械廠;
可見(jiàn)分光光度計(jì):VIS-7220G型,上海軟茂儀器有限公司。
1.2.1 菌種的分離
(1)乳酸菌的富集:在無(wú)菌條件下操作,吸取自然發(fā)酵辣椒醬汁5 m L接種于富集培養(yǎng)基中,置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng)48 h,用于乳酸菌的分離。
(2)乳酸菌的分離、純化:將富集培養(yǎng)樣品用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適的濃度,吸取0.1 m L涂布于分離培養(yǎng)基平板上,35℃恒溫培養(yǎng)48~72 h。挑取可產(chǎn)酸的菌落,進(jìn)行反復(fù)的分離、純化。至純菌落為止。將所獲菌落菌株編號(hào)、保存?zhèn)溆茫?2,13]。
1.2.2 形態(tài)特征鑒定
(1)菌落形態(tài)觀察:仔細(xì)觀察平板培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征,分離單菌落并記錄結(jié)果。
(2)菌株革蘭氏染色:將所分離的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,于100倍的油鏡下觀察。
1.2.3 生化特性 純化后菌株進(jìn)行產(chǎn) H2O2試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)。
乳酸的定性分析:取上述發(fā)酵液約5 m L于試管中,加入10%H2SO41 m L,再加入2%KMnO4溶液1 m L,此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛,把事先在含氨的Ag NO3溶液中浸泡的濾紙條搭在試管上,微火加熱至沸,濾紙變黑則說(shuō)明其有乳酸存在[14-16]。
1.2.4 生理特性
(1)溫度對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸能力的影響:所篩菌株接種MRS液體培養(yǎng)基中,分別于0,10,20,30,40,50,60 ℃培養(yǎng)48 h,測(cè)定發(fā)酵液p H值并用分光光度計(jì)測(cè) OD值[17,18]。
(2)乳酸菌產(chǎn)酸能力:將篩選的乳酸菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中,置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中,靜置培養(yǎng)36 h,每隔4 h測(cè)定發(fā)酵液p H值并用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD 值[17,18]。
(3)耐酸性試驗(yàn):所篩菌株接種于不同p H值的MRS培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)48 h,分光光度計(jì)測(cè)OD值,確定各菌株的最適生長(zhǎng) p H 值[17,18]。
(4)食鹽濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響:在 MRS液體培養(yǎng)基 中分別 加 入 1%,3%,5%,7%,9%,11%,13% 的 食 鹽,所篩菌株分別接種于上述培養(yǎng)基,置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中,靜置培養(yǎng)48 h,測(cè)定發(fā)酵液p H值可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD值[17,18]。
從新疆輕工國(guó)際投資有限公司提供的辣椒中共分離、純化得到17株疑似乳酸菌種,經(jīng)菌落形態(tài)特征觀察和菌株革蘭氏染色(表1)觀察發(fā)現(xiàn),Lact.1(圖1)和Lact.2(圖2)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性,從形態(tài)學(xué)角度初步判定兩株菌均為乳酸菌。
表1 菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of colony
圖1 Lact.1菌體特征(×1 000)Figure 1 Shape character of Lact.1(×1 000)
圖2 Lact.2菌體特征(×1 000)Figure 2 Shape character of Lact.2(×1 000)
對(duì)菌株進(jìn)一步進(jìn)行生化特性鑒定結(jié)果見(jiàn)表2、3。
由表2可知,菌株Lact.1和Lact.2符合乳酸菌不液化明膠,甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性,發(fā)酵不產(chǎn)H2S、H2O2、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸的要求。
綜合上述菌落形態(tài)學(xué)特征及生化特性并參考文獻(xiàn)[19],可發(fā)現(xiàn)Lact.1與植物乳酸桿菌(L.p),Lact.2與腸膜明串珠菌(L.m)所具有的特性一致。
表2 菌落生化特性+Table 2 Biochemical properties of 2 screened strains
2.3.1 最適生長(zhǎng)溫度 由圖3可知,兩菌株在40℃左右時(shí)的光密度值最大,此時(shí)的p H值也是最低,所以?xún)删甑淖罴焉L(zhǎng)溫度在30℃到40℃之間。在20℃以下,45℃以上都不生長(zhǎng)。因此,35℃作為測(cè)定產(chǎn)酸能力、耐酸能力、耐鹽能力等試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度。
2.3.2 產(chǎn)酸能力 由圖4可知,這兩株乳酸菌的產(chǎn)酸速度較快,p H值在36 h后降到4.0左右。所接種乳酸菌產(chǎn)酸速度越快,p H值下降的速度也就越快,抑制雜菌的能力也就越強(qiáng),這樣不但大大縮短了辣椒的發(fā)酵周期,而且降低了產(chǎn)品中的亞硝酸鹽的含量,提高了發(fā)酵辣椒的質(zhì)量。從圖4還可看出,OD值在24 h之內(nèi)就上升到0.5左右,說(shuō)明所選育出的兩株乳酸菌繁殖和產(chǎn)酸的速度是非??斓?。
表3 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sugar fermentation of 2 screened strains
圖3 Lact.1、Lact.2生長(zhǎng)溫度曲線Figure 3 Cave of growth temperature of Lact.1,Lact.2
圖4 Lact.1、Lact.2產(chǎn)酸速度曲線Figure 4 Cave of acid producing of Lact.1,Lact.2
圖5 p H對(duì)2菌株生長(zhǎng)的影響Figure 5 Effect of p H value on the growth of two strains hour
圖6 食鹽濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Figure 6 Effect of salt concentration on the growth of two strains
2.3.3 耐酸性 由圖5可知,Lact.1與 Lact.2兩株乳酸菌在p H值低于5.0和大于9.0時(shí)還能有微弱的生長(zhǎng),當(dāng)p H值低于3.0或大于9.0時(shí),生長(zhǎng)基本停止。由此可知,兩株菌的最適生長(zhǎng)p H值在6左右。
2.3.4 耐鹽性 由圖6可知,Lact.2對(duì)鹽濃度更敏感一些,而Lact.1相對(duì)耐鹽一些。各菌株在食鹽的濃度在7%左右都能生長(zhǎng),當(dāng)食鹽的濃度達(dá)到9%以后,所有的菌株都受到抑制。
(1)通過(guò)對(duì)分離菌株的形態(tài)及生化特性的研究,并參考文獻(xiàn)[19]最終選定Lact.1和Lact.2兩株適用于發(fā)酵辣椒試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)乳酸菌株。鑒定結(jié)果表明Lact.1為植物乳酸桿菌(Lactobacillus planetarium),Lact.2 為 腸 膜 明 串 珠 菌(Leuconostoc mesenteroides)。
(2)兩菌株的生理特性試驗(yàn)研究結(jié)果表明:Lact.1和Lact.2產(chǎn)酸速率大于其他分離菌株,鹽濃度在7%以下時(shí)都可生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度在30℃到40℃之間,在p H值為6的環(huán)境中生長(zhǎng)速度最快。
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Isolation and identification of lactic acid bacteria from natural fermentation peppers
SHA Mo PANG Huan-ming GU Linazi LI Jing YIN Yong YANG Hai-yan
(College of Food Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi,Xinjiang830052,China)
Strains of lactic acid bacteria with producing high-yield lactic acid and well-growing were isolated from naturally fermented peppers.Systematic identification in morphology,physiology and biochemistry,fermentation performance choose that Lact.1 and Lact.2 for chili-jam fermentation.The results indicated that Lact.1 wasLactobacillus planetariumand Lact.2 wasLeuconostoc mesenteroides.Lact 1 and Lact 2 had good lactic acid productivity in the optimum temperature between 30℃to 40℃and the optimum p H 6.0 and could grow well in the salt concentration of 7%.
fermented pepper;lactic acid bacteria;separation and identification
10.3969/j.issn.1003-5788.2012.01.008
國(guó)家科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)項(xiàng)目(編號(hào):
SQ2009GJG40006)
沙漠(1986-),男,新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E-mail:498398739@qq.com
楊海燕
2011-10-11