王志宏，邢沈陽，張桂榮

（1.長春中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 長春 130117；

2.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062；

3.吉林大學生命科學學院，吉林 長春 130012）

啤酒廢酵母中RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的綜合提取

王志宏1，邢沈陽2，張桂榮3

（1.長春中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 長春 130117；

2.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062；

3.吉林大學生命科學學院，吉林 長春 130012）

為實現(xiàn)RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的綜合提取，通過堿－酶提取法和優(yōu)化稀堿提取條件，研究了溫度、NaOH質(zhì)量分數(shù)對RNA提取的影響.結(jié)果表明：溫度為100℃，NaOH質(zhì)量分數(shù)為4%時，提取率為7.65%，純度為70.24%.進一步比較中性蛋白酶和堿性蛋白酶對β-（1，3）-D-葡聚糖提取的影響，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶得到的產(chǎn)物較多，純度較高.實驗結(jié)果為進一步的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

啤酒廢酵母；RNA；β-（1，3）-D-葡聚糖；堿－酶提取法

啤酒廢酵母為啤酒生產(chǎn)的主要廢棄物，它含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、維生素、礦物質(zhì)等多種高營養(yǎng)、高附加值的組分，且安全、無毒，利用價值非常高.而目前啤酒酵母的主要處理方式是干燥后作為飼料或直接排放，有效成分并沒有得到充分的利用.

免疫核糖核酸（immunogenic RNA）是動物體內(nèi)一種具有轉(zhuǎn)移免疫性功能的生物大分子，是一種重要的免疫觸發(fā)劑或免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛應用于醫(yī)藥與食品行業(yè).β-（1，3）-D-葡聚糖是一種極富生物活性的免疫多糖，目前已證實它對腫瘤、肝炎、糖尿病、心血管疾病、高血脂等疑難病都有良好的治療效果.

隨著啤酒等發(fā)酵行業(yè)的快速發(fā)展，大量的發(fā)酵副產(chǎn)物隨之產(chǎn)生，如何利用這些低值的副產(chǎn)物，做到既不污染環(huán)境，又能產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益，一直是研究的熱點.本研究利用堿－酶提取法，進行了從啤酒廢酵母中提取RNA 和β-（1，3）-D-葡聚糖的綜合實驗，以得到較高純度的RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖，為實現(xiàn)低成本的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)［1－5］.

1 材料和方法

1.1 主要試劑

啤酒酵母干粉，日本W(wǎng)AKO酵母RNA標準樣，中性蛋白酶和堿性蛋白酶（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 RNA的提取及影響因素

1.2.1 RNA標準曲線的制定

準確稱取10.0mg RNA，用少量0.05mol／L NaOH濕透，然后用玻璃棒研磨成糊狀的混濁液，加入少量蒸餾水，混勻，調(diào)pH＝7.0，再用蒸餾水定容至10mL.此溶液即為標準RNA母液（1mg／mL）.

取母液1.0mL置10mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，此溶液為100μg／mL的標準RNA溶液.

取6支干凈烘干的試管，按表1的編號及配置加入試劑，然后置沸水中加熱25min，取出冷卻，以0號管作對照，于670nm波長處測定吸光度值，取兩管平均值.以RNA濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標作圖，繪制標準曲線.

表1 RNA標準品的配置

1.2.2 啤酒酵母中RNA的提取

準確稱取10g干燥酵母粉，加入100mL水充分洗滌，4 800r／min離心10min；將沉淀物重復洗滌、離心至洗滌液澄清為止.

將上述沉淀放入100mL燒杯中，水洗兩次，離心后向沉淀物質(zhì)中加入4%NaOH 30mL，然后放入沸水中水浴1h.將上述提取液取出，冷卻，以4 000r／min離心10min，取上清液，倒入燒杯中，調(diào)pH＝5.5.然后邊攪拌邊緩慢加入150mL 95%的乙醇，以4 000r／min離心10min，棄去上清液，用少量95%乙醇洗滌3次，常溫下干燥，得RNA產(chǎn)品.測量檢測后密封放入4℃冰箱保存［6－8］.

1.2.3 溫度對RNA提取的影響

分別準確稱取10g干燥酵母粉，如前述在啤酒酵母中提取RNA的方法，分別在80℃，85℃，90℃，95℃，100℃的條件下提取1h，得到5種RNA粗制品.稱量自制的5種干燥RNA粗制品各10mg（純度約為50%），控制RNA的濃度在10～100μg／mL范圍內(nèi)，按標準RNA溶液方法配制10mL，如前述進行RNA含量的測定.

1.2.4 NaOH質(zhì)量分數(shù)對RNA提取的影響

分別準確稱取10g干燥酵母粉，如前述提取RNA的方法，用質(zhì)量分數(shù)分別為2%，4%，6%，8%的NaOH溶液，100℃提取1h，得到4種RNA粗制品.稱量自制的4種干燥RNA粗制品各10mg（純度約為50%），控制RNA的濃度在10～100μg／mL范圍內(nèi)，按標準RNA溶液方法配制10mL，進行RNA含量測定.

1.3 β-（1，3）-D-葡聚糖的提取與含量測定

1.3.1 葡萄糖標準曲線的制定

苯酚－硫酸法標準曲線的制作：分別吸取40μg／mL的葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL，加去離子水補足2mL.然后加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5mL，靜止10min，搖勻，室溫放置20min后于490nm測定吸光度.以標準糖溶液的量（mL）為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線.

1.3.2 β-（1，3）-D-葡聚糖的提取

將提取RNA后的沉淀物質(zhì)按照15mL∶1g的比例加入3%的NaOH溶液，在80℃水浴條件下水解2h，離心.將沉淀物質(zhì)洗滌后加入100mL去離子水，并分成兩份.調(diào)節(jié)1號樣品pH＝8，加入堿性蛋白酶500μL，70℃下水解24h；調(diào)節(jié)2號樣品pH＝7，加入中性蛋白酶0.019g，40℃水解24h.離心，沉淀物質(zhì)用無水乙醇洗滌、干燥［9－13］.

1.3.3 β-（1，3）-D-葡聚糖含量的測定

稱取β-（1，3）-D-葡聚糖提取樣品4mg，放入50mL的具塞刻度試管中，加入10mol／L的硫酸溶液5mL，水解25min后，將硫酸稀釋至2mol／L，封管后于95℃水浴鍋中水解18h，獲得β-（1，3）-D-葡聚糖的水解液.按照苯酚－硫酸法于490nm下測定吸光度.

2 實驗結(jié)果

2.1 影響RNA提取的因素

2.1.1 RNA標準曲線

本研究采用地衣酚-Cu2＋法測定了RNA的含量，共獲得6組吸光度值，結(jié)果見表2；制定的RNA標準曲線見圖1.

表2 RNA標準品的吸光度

2.1.2 酵母中RNA的含量

RNA提取樣品吸光度為0.320，帶入經(jīng)計算得出RNA的純度為70.24%.

2.1.3 溫度對RNA提取的影響

如表3所示，溫度在80℃～100℃時，隨著溫度的升高，RNA產(chǎn)率不斷上升，在100℃時達到最高.因為溫度高于100℃時，RNA容易分解，影響產(chǎn)率.綜合考慮可控性、產(chǎn)率等眾多因素影響，選擇的溫度為100℃.

圖1 RNA標準曲線

表3 抽提溫度對RNA提取產(chǎn)量的影響g

2.1.4 NaOH質(zhì)量分數(shù)對RNA提取的影響

如表4所示，堿提加入的NaOH質(zhì)量分數(shù)為4%時產(chǎn)量最高，隨著濃度的增加產(chǎn)量明顯下降，可能是由于濃度高破壁效果不好以及核酸變性所致.因此提取時NaOH質(zhì)量分數(shù)選擇為4%.

表4 NaOH質(zhì)量分數(shù)對RNA提取產(chǎn)量的影響 g

在100℃，NaOH質(zhì)量分數(shù)為4%的條件下進行綜合提取，得到的RNA產(chǎn)物干燥后呈乳白色略微帶有些黃色，干燥直到恒重后經(jīng)稱量得到RNA 0.765g，提取率為7.65%.

2.2 β-（1，3）-D-葡聚糖含量的測定

2.2.1 葡萄糖的標準曲線

由標準糖溶液測得的各濃度梯度的吸光度值見表5，制作的標準曲線見圖2.

表5 標準糖溶液的吸光度值

2.2.2 β-（1，3）-D-葡聚糖含量

經(jīng)中性蛋白酶作用后得β-（1，3）-D-葡聚糖0.684g，經(jīng)堿性蛋白酶作用后得β-（1，3）-D-葡聚糖0.560g.測得樣品吸光度分別為0.282，0.266，帶入計算得中性蛋白酶和堿性蛋白酶處理得到的產(chǎn)物純度分別為76.6%和61.6%.

3 討論

本實驗為實現(xiàn)工業(yè)化的RNA提取提供了依據(jù).當然，盡管本實驗給出了優(yōu)化分析方法，但要想使β-（1，3）-D－葡聚糖的研究、生產(chǎn)和實際應用等能夠產(chǎn)業(yè)化，其含量分析須有國際統(tǒng)一標準.本實驗所設(shè)計的提取流程僅局限于RNA和β-（1，3）-D-葡聚糖的提取利用，而啤酒酵母中仍然含有大量的其他營養(yǎng)物質(zhì)，如取超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱苷肽（GSH）、果糖二磷酸鈉（FDP）、B族維生素和酶等.如何能夠最大限度地在同一平臺上進行多種營養(yǎng)物質(zhì)的綜合提取，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)濟價值的最大化是今后研究的方向.

圖2 苯酚－硫酸法糖溶液的標準曲線

［1］ 常雅寧，俞建瑛，袁勤生.啤酒廢酵母的綜合利用［J］.微生物學雜志，2001（2）：30-33.

［2］ 胡瑛.啤酒酵母的簡單介紹及其在食品中的應用與開發(fā)［J］.現(xiàn)代測量與實驗室管理，2007（4）：34-38.

［3］ 姜桂榮，秦寰勛.核酸膳食治療高血脂癥的探討［J］.營養(yǎng)學報，1998，21（1）：55-58.

［4］ 黃麗紅，宋偉民，陸亞松.β-（1，3）-D-葡聚糖對機體健康的影響［J］.國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊，2001，28（3）：163-166.

［5］ 孔明，姚汝華.啤酒廢酵母綜合利用的探討［J］.廣州食品工業(yè)科技，2003，19（2）：59-62.

［6］ 黃淑霞，史紅梅.機械破壁和鹽法結(jié)合從啤酒酵母中提取 RNA［J］.釀酒，2004（4）：22-25.

［7］ 卞菁，屠春燕，歐陽平凱.兩種廢棄酵母 RNA提取工藝比較［J］.南京化工大學學報，1998，20（1）：64-67.

［8］ BROWN G D，GORDON S.Fungal beta-glucan and mammalian immunity［J］.Immunity，2003，19（3）：311-315.

［9］ 胡曉鐘，明杰，甄寶貴，等.用酸堿法從面包酵母中提取β-（1，3）-D葡聚糖［J］.工業(yè)微生物，2000，30（1）：28-31.

［10］ 黃剛良，劉曼西.啤酒酵母中β-（1，3）-D葡聚糖的提取及其機理研究［J］.精細化工，2003（8）：458-459.

［11］ 姜錫瑞，段鋼.酶制劑實用技術(shù)手冊［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002：156-158.

［12］ DAVID J MANNERS，ALAN J MASSON，JAMES C PATTERSON.The structure of aβ-（1-3）-D-Glucan from yeast cell walls［J］.Biochem，1976，135：19-31.

［13］ 王志宏，薛建斌，姜文艷，等.蝙蝠葛堿提多糖對 Hela細胞增殖的影響［J］.東北師大學報：自然科學版，2011，43（3）：132-136.

Synthetic extraction of RNA andβ-（1，3）-D-Glucan from waste beer yeast

WANG Zhi-hong1，XING Shen-yang2，ZHANG Gui-rong3

（1.Basic Medical College，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；
2.Animal Husbandry Veterinary College，Jilin University，Changchun 130062，China；
3.Life Science College，Jilin University，Changchun 130012，China）

The present paper studies the influence of temperature and NaOH concentration on the synthetic extraction of RNA andβ-（1，3）-D-Glucan from waste beer yeast.The experiment uses the alkali-enzyme extraction method and optimizes the dilute alkali extraction conditions to bring about the synthetic extraction.The experiment shows that the extraction rate is 7.65%and the degree of purity is 70.24%with a temperature of 100°C and the concentration of NaOH for 4%.Furthermore，the experiment investigates the influence of neutral protease and alkaline protease on the extraction of β-（1，3）-D-Glucan and finds that neutral protease may facilitate moreβ-（1，3）-D-Glucan of higher purity.It is believed that the experiment results lay a foundation for industrial production.

waste beer yeast；RNA；β-（1，3）-D-Glucan；alkali-enzyme extraction method

R 963

310·4730

A

1000-1832（2012）02-0095-04

2011-12-13

國家自然科學基金資助項目（30870251，31070309）；教育部985平臺項目.

王志宏（1965-），男，副教授，主要從事中醫(yī)藥及生化藥物研究；通訊作者：張桂榮（1964-），女，博士，教授，主要從事分子生物學及生物化學研究.

方 林）