石志遠，顧 韜，張 超，王德利，阮狄克

CT引導下髓核鉗取技術(shù)制備犬椎間盤退變模型的實驗研究

石志遠，顧 韜，張 超，王德利，阮狄克

目的 探索CT引導下使用活檢槍髓核鉗取技術(shù)構(gòu)建犬椎間盤退變模型可行性，比較不同型號活檢槍制備犬椎間盤退變模型效力。方法 選取6只1歲齡雌性雜種犬。將犬腰1-2、腰3-4及腰5-6椎間盤納入退變模型制備實驗研究，并行隨機分組。A組使用18號活檢槍;B組使用20號活檢槍;C組使用24號活檢槍。行經(jīng)皮椎間盤穿刺。術(shù)后4周及12周分別行核磁及數(shù)字平片檢查，評估各組椎間盤高度變化及髓核含水量狀態(tài);術(shù)后12周處死動物，行組織學分析。結(jié)果 每組取出髓核組織量A組(3.0±0.53)mg、B組(2.01±0.34)mg和C組(3.0±0.53)mg。平均操作時間為1.4 h;出血量為5～10 ml。術(shù)前椎間盤高度數(shù)測量做為基線，3組間高度比較無明顯差別(P＞0.05)。術(shù)后3組椎間盤高度均有不同程度降低，但組內(nèi)差異及同一時間點組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。3組中，MRI相對信號強度均出現(xiàn)下降，與術(shù)前對比無統(tǒng)計學差別(P＞0.05)。術(shù)后第12周，A組MRI相對信號強度出現(xiàn)明顯下降，與B組和C組相比下降程度具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與術(shù)前相比，術(shù)后第12周A組和B組降低程度均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 CT引導下活檢槍髓核鉗取技術(shù)可用于犬椎間盤退變模型制備;20號活檢槍制備的退變模型在12周觀察期內(nèi)顯示出較為緩和、重復(fù)性高、可信性強的退變進程，適用于椎間盤退變生物治療研究。

椎間盤退變;相對灰度指數(shù);動物模型

椎間盤退行性疾病在世界各國發(fā)病率均較高，加重各國醫(yī)療經(jīng)濟負擔，減少社會平均勞動時間并降低患者生活質(zhì)量。盡管已有多種治療策略應(yīng)用于該疾病及相關(guān)疾病的治療，但其療效仍然有限［1-2］。隨著新的治療策略的不斷開發(fā)，適合于檢驗新治療方法療效的椎間盤退行性疾病動物模型的開發(fā)也勢在必行。目前，纖維環(huán)損傷誘導椎間盤退變的動物模型被廣大的研究機構(gòu)及學者所接受［3-5］。然而，模型制備方式多選擇開放手術(shù)直視下?lián)p傷纖維環(huán)結(jié)構(gòu)引發(fā)椎間盤退變，這種方式不僅增加了實驗動物死亡風險、延長術(shù)后康復(fù)時間，而且存在椎間盤髓核急性突出及嚴重退變的可能。CT引導下經(jīng)皮穿刺活檢術(shù)作為一種安全、可靠、成熟的臨床應(yīng)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷［6］。因此我們設(shè)想采用該技術(shù)，通過CT三維定位，經(jīng)皮穿刺進入髓核組織，鉗取一定量的髓核組織，以此來誘導椎間盤退變進程的發(fā)生，從而探索髓核鉗取技術(shù)制備椎間盤退變動物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 雜種犬6只(海軍總醫(yī)院動物實驗中心)，電子計算機X射線斷層掃描機(Philips，美國)，鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞，中國)，咪達唑侖注射液(宜昌人福，中國)，活檢槍(Quickcore，美國)，電子天平(上海天平儀器，中國)，數(shù)字X線成像儀(Siemens，德國)，核磁共振掃描儀(Signa Horizon，美國)，福爾馬林(4%甲醛配置)，EDTA脫鈣液(舜百，中國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 動物選取 6只1歲齡雌性雜種犬，體質(zhì)量10～12 kg，由海軍總醫(yī)院動物實驗中心提供，并在制備椎間盤退變模型前隔離檢疫10 d。實驗前行核磁及數(shù)字平片檢測，剔除脊柱結(jié)構(gòu)異常及已發(fā)生的椎間盤退變的實驗動物。動物實驗經(jīng)倫理委員會核準［SYXK(軍)2002-011］，實施于海軍總醫(yī)院動物實驗中心。

1.3 CT引導下制備犬椎間盤退變模型 將犬腰1-2(L1-2)、腰3-4(L3-4)及腰5-6(L5-6)椎間盤納入退變模型制備實驗研究，并行隨機分組。A組使用18號活檢槍;B組使用20號活檢槍;C組使用24號活檢槍。

使用氯胺酮(10 mg/kg)和咪達唑侖(0.5 mg/kg)對實驗動物進行麻醉誘導后，對犬左側(cè)腰背部皮膚進行備皮，顯露皮膚面積30 cm×15 cm，并放置定位線，行犬腰椎薄層 CT掃描(層厚0.625 mm)，三維重建顯示犬腰1椎體至腰7椎體。確定L1-2、L3-4及L5-6椎間盤平面后，根據(jù)定位線位置確定入針角度、深度及入針點。定位完成后，退出檢查床，移除定位線，于入針點周圍5 cm×5 cm區(qū)域內(nèi)行碘伏消毒(3次)，鋪洞巾，根據(jù)已確定入針點、入針角度及深度，使用活檢槍行經(jīng)皮椎間盤穿刺。出現(xiàn)突破感后，停止穿刺，CT掃描確定活檢槍位置位于椎間盤內(nèi)后，撤出活檢槍1 cm，同時推出活檢取材針芯，鉗取椎間盤髓核組織，電子天平稱重。以此方法分別使用不同型號活檢針對各組間盤進行穿刺鉗取髓核組織操作。失血量、操作時間、鉗取髓核組織重量及術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥均詳細記錄。6只動物均在同一實驗條件下進行穿刺。

術(shù)后4周及12周分別行核磁及數(shù)字平片檢查，評估各組椎間盤高度變化及髓核含水量狀態(tài);于術(shù)后12周處死動物，收集各組樣本行組織學分析。

1.4 影像學分析 基于數(shù)字X線影像學技術(shù)，椎間盤高度變化使用“三中線法”進行測定［7］。于犬腰椎側(cè)位數(shù)碼X線片上確定實驗節(jié)段，確定包含實驗椎間盤的最上端及最下端椎體，本實驗為腰1椎體至腰6椎體，設(shè)定腰1椎體最上端前緣及后緣及腰椎體最下端前緣及后緣為標志點，分別于椎體前后緣繪制平行直線 (圖1)。將2條平行線的之間距離等分3份，分別另行繪制直線A、B和C。3條直線分別于椎間盤上下緣與椎體交匯，形成D、E和F線段，通過電腦軟件(Photoshop 7.0，Adobe)對線段D、E和F進行測量，取平均值(D+E+F)/3。

圖1 三中線法測量椎間盤高度

MRI中，T2加權(quán)像可反映組織中的水化狀態(tài)，在本實驗中，用于連續(xù)、無創(chuàng)觀察髓核含水量的變化，間接反映椎間盤退變程度。使用Photoshop軟件工具，獲得T2相椎間盤灰度值，與相同節(jié)段水平腦脊液線灰度進行對比，獲得標準化相對灰度指數(shù)(relative grayscale index，RGI)［8］。數(shù)據(jù)測量由經(jīng)驗豐富的2名獨立觀察人員完成，并分別記錄。

1.5 組織學分析 實驗動物于術(shù)后觀察3個月。

到達觀察期后，實驗動物在麻醉狀態(tài)下處死，獲得各組椎間盤樣本，包括髓核、纖維環(huán)、上下軟骨終板和少量終板下骨。樣本組織浸泡于福爾馬林溶液(4%甲醛)1周后，放入脫鈣液(20%EDTA)中進行脫鈣處理1個月。終板下骨軟化后，進行脫水、石蠟包埋。于石蠟切片機上，切去6 μm厚組織切片行蘇木素和伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)，分別顯示細胞構(gòu)成及蛋白多糖含量變化。

1.6 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物術(shù)后基本情況 在椎間盤退變模型制備過程中，每組取出髓核組織量分別為A組(3.0±0.53)mg、B組(2.01±0.34)mg和 C組(3.0±0.53)mg;平均操作時間為1.4 h;出血量為5～10 ml。有2只動物在術(shù)中及術(shù)后均出現(xiàn)程度不一的神經(jīng)損害征象，顯示左側(cè)后肢跛行。其中，1只動物跛行狀態(tài)在術(shù)后2周后逐漸緩解;另1只動物于觀察期滿后，跛行狀態(tài)仍未見明顯改善。術(shù)后無明顯感染跡象發(fā)生。經(jīng)過3個月的觀察期，實驗動物于麻醉狀態(tài)下處死，每組獲得實驗樣本6個(表1)。

表1 樣本數(shù)量分布

2.2 椎間盤高度 數(shù)字X線數(shù)據(jù)采集于術(shù)前、術(shù)后4周及術(shù)后12周，共3個時間點(圖2)。術(shù)前椎間盤高度數(shù)測量做為基線，3組間高度無明顯差別(P＞0.05)。術(shù)后3組椎間盤高度均有不同程度降低，但組內(nèi)差異及同一時間點組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖2 椎間盤高度變化

2.3 椎間盤相對灰度指數(shù) 矢狀位髓核中心MRI資料采集于術(shù)前、術(shù)后4周及術(shù)后12周，共3個時間點(圖3)。術(shù)后第4周，3組中，RGI與術(shù)前對比，不具有統(tǒng)計學差別(P＞0.05)。術(shù)后第12周，A組RGI出現(xiàn)明顯下降，與B組和C組相比，下降程度具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);B組與C組間，RGI下降程度無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。與術(shù)前相比，術(shù)后第12周A組和B組降低程度均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而C組RGI降低程度無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)合改良Pfirrmann分級，在第12周時，A組椎間盤髓核信號明顯降低，椎間盤高度降低接近30%，可歸為5～6級;B組椎間盤髓核信號雖有降低，但明顯高于椎間盤纖維環(huán)外層信號強度，可歸為3～4級;C組椎間盤髓核信號無明顯改變，接近腦脊液強度，高度亦無改變，歸為1級。

圖3 椎間盤相對灰度指數(shù)

2.4 組織病理學檢查 術(shù)后12周，獲取椎間盤組織樣本行組織學染色及分析。HE染色顯示，A組內(nèi)終板結(jié)構(gòu)較為完好，但髓核含量下降，類軟骨樣髓核細胞明顯減少，取而代之的是體積較小、基質(zhì)分泌功能低下的軟骨細胞。且內(nèi)層纖維環(huán)結(jié)構(gòu)松散，髓核基質(zhì)中蛋白多糖含量下降，終板與髓核組織交接區(qū)域可見纖維結(jié)締組織形成(圖4A)，退變程度處于ThompsonⅢ級。B組椎間盤髓核含量無明顯改變，HE染色顯示深藍色，髓核內(nèi)蛋白多糖成分含量較高。HE染色顯示髓核內(nèi)細胞數(shù)量較多，體積大;終板結(jié)構(gòu)完整，終板內(nèi)軟骨細胞無明顯增生;但終板組織延伸入纖維環(huán)結(jié)構(gòu)及髓核組織內(nèi)，椎間盤結(jié)構(gòu)開始改變(圖4B)，退變程度處于ThompsonⅡ級。C組內(nèi)髓核組織、纖維環(huán)及終板結(jié)構(gòu)完整，類軟骨樣髓核細胞數(shù)量較多，細胞外基質(zhì)蛋白多糖含量豐富，無明顯椎間盤退行性改變(圖4C)。

圖4 組織學分析(上圖×10，下圖×40)

3 討論

實驗結(jié)果表明，CT引導下經(jīng)皮髓核鉗取技術(shù)可誘導犬椎間盤退變的出現(xiàn)。經(jīng)過影像學及組織學分析，20號活檢槍可適合于制備退變較為緩和、重復(fù)性高的椎間盤退變模型。盡管18號活檢槍亦可誘發(fā)椎間盤退變，并且無急性髓核突出，但椎間盤退變速度較快，程度較為嚴重。經(jīng)過18號活檢槍處理后，椎間盤在術(shù)后3個月內(nèi)，髓核MRI T2信號降低超過50%，同時終板結(jié)構(gòu)也有改變，改良Pfirrmann分級至5～6級，可歸為中晚期退變，不適用于椎間盤退行性疾病治療方法的模型，尤其不適用于生物治療。與之相反，在24號活檢槍組中，椎間盤內(nèi)結(jié)構(gòu)、細胞組成均無明顯異常改變，這可能需要較長的觀察期，故亦不是良好的椎間盤退變模型。

由學者Lipson等［9-10］描述的經(jīng)典纖維環(huán)損傷模型，是使用11號刀片對纖維環(huán)進行全層損傷。在損傷后4周，髓核組織即被纖維軟骨樣組織所替代。這可能是由于損傷后，應(yīng)力作用使髓核組織的通過損傷通道發(fā)生急性突出，周圍軟骨細胞、纖維環(huán)細胞增生修復(fù)形成纖維軟骨樣組織［11-13］。本實驗中，雖然各組移除髓核組織質(zhì)量不同，但在術(shù)后4周復(fù)查核磁可見各組間髓核組織水合程度無明顯差異?？赡苡幸韵?點原因:①髓核鉗取量較少，MRI無法檢測;②髓核鉗取區(qū)域并非位于椎間盤中央矢狀位平面;③術(shù)后無明顯急性椎間盤髓核突出發(fā)生。盡管如此，在A組中，位于纖維環(huán)內(nèi)通向髓核的活檢槍通道，在大體標本中仍清晰可見，其間由纖維結(jié)締組織填充。提示在纖維環(huán)損傷模型中，椎間盤髓核組織有可能會發(fā)生慢性突出。在一項關(guān)于豬的退變椎間盤體外生物力學研究中，Wang等［13］發(fā)現(xiàn)當穿刺針型號超出22號，椎間盤髓核出現(xiàn)不可控的泄漏概率明顯增加。在本研究中18號和20號活檢槍實驗組髓核泄漏發(fā)生率較低，可能是由于:①髓核鉗取后，椎間盤內(nèi)壓力降低;②樣本數(shù)量較少;③物種間的差異。

CT導航技術(shù)在制備椎間盤退變的應(yīng)用中，可有效降低主觀偏倚引發(fā)的椎間盤節(jié)段定位錯誤。開放性手術(shù)中，椎間盤節(jié)段定位多利用下端的髂骨翼和(或)上端的末節(jié)肋椎關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)［14］。物種內(nèi)差異或各體變異可增加此種定位方式失敗概率;使用較大的手術(shù)切口充分顯露上、下端的解剖結(jié)構(gòu)，增加胸膜損傷及大出血的風險，也會延長動物術(shù)后康復(fù)時間。另外，側(cè)臥位時，動物呈弓形狀態(tài)，各節(jié)段椎間盤并非平行排列，借助CT導航技術(shù)，穿刺入針點，入針角度及深度均可以得到保障，而避免不必要的損傷;直視下，操作者需要根據(jù)經(jīng)驗提供相對正確的穿刺通道，保證穿刺針垂直進入纖維環(huán)，而不傷及終板組織。在本研究中，A組有1例發(fā)生椎間盤終板損傷，提示除了髓核泄漏，穿刺針的型號過大還可增加終板損傷概率。

在本研究中我們提出一項較為直觀、可量化的指標——髓核鉗取質(zhì)量，用于預(yù)測和評估椎間盤退變進程，增強動物模型制備的可重復(fù)性。該研究中，在制備椎間盤退變模型時，將鉗取出的髓核組織進行稱重，分別為A組(3.00±0.53)mg、B組(2.01±0.34)mg和C組(3.00±0.53)mg。將其與模型制備后12周時的MRI對信號強度進行相關(guān)性分析，得出兩者成負相關(guān)的結(jié)果(r=－0.766)。雖然活檢槍的直徑對椎間盤退變進程也存在一定的影響，但是這一結(jié)果為我們進一步探討椎間盤退變可控性動物模型制備提供了新的思路。但是鉗取髓核治療指標也存在不足之處，不同動物間及相同動物不同節(jié)段間，髓核含量均不相同，鉗取相同的髓核量也可導致不同程度的退變。鉗取髓核治療與間盤整體髓核質(zhì)量之比可能是更好的指標，但是目前仍無有效手段可對活體內(nèi)椎間盤髓核質(zhì)量進行無創(chuàng)化測定。

目前，常用的纖維環(huán)損傷模型多是通過控制穿刺深度或穿刺后真空抽吸時間來保證椎間盤退變動物模型制備的可靠性及可重復(fù)性。分析認為:纖維環(huán)針刺退變模型的制備需要的穿刺針直徑應(yīng)大于40%椎間盤高度［15］。在一項關(guān)于大鼠椎間盤退變模型研究中［16］，21號皮下注射針被用于制作纖維環(huán)損傷，并且控制損傷深度于5 mm，避免椎間盤的結(jié)構(gòu)急性改變及由此引發(fā)的創(chuàng)傷性椎間盤退變。但是大型號的穿刺針可增加髓核泄漏及終板損傷概率，因此需要在誘發(fā)椎間盤退變與更為合理的穿刺針型號選擇中尋求平衡。本研究中使用的活檢槍型號由18～24號，口徑為1.2 mm至0.55 mm，占犬椎間盤高度的8%～17%。盡管口徑尚未達到椎間盤高度40%，在A組的1例樣本中仍出現(xiàn)了髓核泄漏現(xiàn)象。Sakai等［17］在探索制備兔椎間盤退變針刺模型研究中，使用21號針頭，連接10 ml注射器，在針頭穿刺進入椎間盤髓核組織后，在一定時間內(nèi)保持注射器內(nèi)負壓狀態(tài)，對髓核組織進行抽吸。然而隨后的實驗研究證明，這種髓核抽吸方式引發(fā)的椎間盤退變速度過快，程度過于嚴重［7］。本研究使用活檢槍鉗取少量的髓核組織，實驗組B組，使用20號活檢槍，在術(shù)后第12周，影像學顯示MRI T2信號輕度降低;組織學顯示椎間盤內(nèi)結(jié)構(gòu)基本完整，內(nèi)側(cè)纖維環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，髓核內(nèi)蛋白多糖含量無明顯降低。我們認為該組椎間盤基本處于退變早中期，更適合于椎間盤退變模型制備。

椎間盤退變的生物治療需要處于早中期退變的動物模型。在本研究中，雖然A組的椎間盤高度在3個月的觀察期內(nèi)未有明顯降低，但其MRI T2信號提示該組椎間盤退變處于中晚期改變。我們考慮，影像學結(jié)果差異可能是由于犬脊柱受力方式不同于人類，犬的脊柱很少受到軸向壓力，使得椎間盤高度變化滯后于髓核含水量的變化。由于A組椎間盤上下終板出現(xiàn)異常改變，提示椎間盤營養(yǎng)通道受損，可能嚴重干擾生物治療實驗結(jié)果。因此，18號活檢槍不適于犬椎間盤退變模型的制備。

CT導航下髓核鉗取技術(shù)僅適用于體型較大的哺乳動物(犬、羊)。因為在活檢槍穿刺進入椎間盤后需要保證活檢針芯完全進入髓核組織區(qū)域，以保證每次鉗取髓核質(zhì)量保持一致。另外，由于犬可分為軟骨缺陷型及非軟骨缺陷型兩類，1歲齡的兩種犬內(nèi)具有不同髓核結(jié)構(gòu)及細胞成分，鉗取髓核組織不具有可比性，因此本研究均使用非軟骨缺陷型雜種犬。另外，本研究選取間隔節(jié)段間盤為實驗對象，以避免相鄰間盤退變誘發(fā)的“臨椎效應(yīng)”。學者Sobajima等［18］，在椎間盤退變研究中發(fā)現(xiàn)，在退變節(jié)段的相鄰節(jié)段椎間盤亦出現(xiàn)核磁信號的降低。該現(xiàn)象并未在本研究中出現(xiàn)，可能歸結(jié)于:①較短的觀察期;②間隔節(jié)段退變，分散應(yīng)力分布。

雖然該技術(shù)降低了出血風險及術(shù)中術(shù)后并發(fā)癥，但該技術(shù)受到定位準確性、操作技術(shù)的限制，操作時間與開放手術(shù)有明顯差異。犬的皮膚與皮下組織結(jié)合較為疏松，在穿刺時可能活檢槍在進入皮下組織后可能出現(xiàn)偏移，影響穿刺準確性，并延長穿刺時間，增加終板損傷概率，需要在實驗前進行預(yù)實驗，提高操作技術(shù)完成學習曲線。此外，CT掃描對實驗人員及實驗動物的損害作用，需要在操作時做好防護工作。

4 結(jié)論

本研究通過CT三維定位，經(jīng)皮穿刺進入髓核組織，鉗取髓核組織，誘導椎間盤退變進程的發(fā)生。研究證實在CT導航下可使用活檢槍制備犬椎間盤退變模型，并通過影像學及組織學分析證明20號活檢槍是制備犬椎間盤退變模型的理想選擇，為探索新的椎間盤退變生物治療治療方法奠定基礎(chǔ)。

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Computed tomography guided nucleus pulposus biopsy for canine intervertebral disc degeneration preparation:a radiology and histology

SHI Zhi-yuan，GU Tao，ZHANG Chao，WANG De-li，RUAN Di-ke
(Department of Orthopedics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo apply a minimal invasive method in disc degenerative disease animal model preparation with biopsy gun assisted with CT scan，and evaluate the accuracy，efficiency of this process with radiology and histology analysis．MethodsThe canine intervertebral disc of lumbar 1-2，lumbar 3-4，and lumbar 5-6 was divided into 3 groups randomly．Group A:18 Gauge of biopsy gun，Group B:20 Gauge of biopsy gun，Group C:24 Gauge of biopsy gun．After the lumbar spine scanned with CT，a certain volume of nucleus pulposus tissue was removed by the biopsy gun．Radiology examination was carried out at preoperation，4 weeks and 12 weeks postoperation．Each sample was harvested at 12 weeks postoperation for histology evaluation．ResultsIn the percutaneous biopsy procedure，the weight of NP tissue was removed:(3.0±0.53)mg in Group A，(2.01±0.34)mg in Group B，and(0.99)±0.12 mg in Group C．During the observation period，no significant differences in disc height were found between groups at each time point(P＞0.05)．The signal intensity of MRI was reduced significantly(P＜0.05)in Group A when compared with Group C at 12 weeks，and decreased content of nucleus pulposus，the number of nucleus pulposus cells and the loose of annulus fibrous at the inner area was observed at both HE and Saforini-O staining in Group A at 12 weeks．ConclusionCT-guided percutaneous biopsy could be applied in intervertebral disc degeneration preparation of canine model．20 G biopsy gun would be the optimal choice in this procedure．

Disc degeneration;Relative grayscale index;Animal model

R681.5－332;R814.42

A

2095-3097(2012)01-0017-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.005

100048北京，海軍總醫(yī)院(石志遠，顧 韜，張 超，王德利，阮狄克)

阮狄克，E-mail:ruandike@yahoo.com.cn

2012-06-12 本文編輯:馮 博)