徐霜清， 祝愛(ài)珍， 劉成成， 許婷婷， 陳小宇， 劉革修△

(1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，湖南 長(zhǎng)沙410013;2 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東 廣州510330;3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州510632)

盡管酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼可抑制BCRABL 激酶活性，對(duì)慢性期慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)治療有效，但很難達(dá)分子學(xué)緩解。越來(lái)越多的研究表明，白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根本原因是白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSC)的存在［1］。因此，尋找新的、清除LSC 的藥物以減少耐藥與復(fù)發(fā)十分必要。最近的研究發(fā)現(xiàn)一種名為鹽霉素(salinomycin)的抗生素可以直接殺死腫瘤干細(xì)胞，其殺死小鼠身上乳腺癌干細(xì)胞的效力比普通抗癌藥物泰克索(taxol)高100 倍［2－3］。本實(shí)驗(yàn)觀察鹽霉素對(duì)耐格列衛(wèi)的白血病細(xì)胞株K562/Glv 細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為鹽霉素應(yīng)用于慢性粒細(xì)胞白血病治療探索新的思路。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

鹽霉素、臺(tái)盼藍(lán)、Triton X－100、DMSO 和PI 染料購(gòu)自Sigma。RPMI－1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco。細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)、caspase－3、caspase－8、caspase－9 和JC－1線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞色素C 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bio-Vision。Fluo－3AM 購(gòu)自Biotium。Epics XL 型流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman Coulter。Annexin V－PI 雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自Invitrogen。

2 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

格列衛(wèi)耐藥慢粒細(xì)胞株K562/Glv 由天津中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈(zèng)。細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液，置于含5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，2 ～3 d 傳代。

3 鹽霉素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

檢測(cè)鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞的劑量－效應(yīng)關(guān)系，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度為2 ×108cells/L，100 μL/well，鹽霉素設(shè)有0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 μmol/L 濃度梯度，設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)DMSO 對(duì)照孔和不加細(xì)胞的調(diào)零孔，5%CO2、飽和濕度、37 ℃孵育48 h，加入CCK－8 試劑孵育3 h 后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度(A)值(測(cè)量波長(zhǎng)490nm)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)=0.37 μmol/L。繪制0.2 μmol/L 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞的時(shí)間－效應(yīng)曲線(xiàn)，孵育時(shí)間:0、24、48、72、96 h，測(cè)量方法同上。

4 Annexin V－PI 雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的K562/Glv 細(xì)胞，2 ×105cells/well接種至12 孔板內(nèi)，以0.2 μmol/L 鹽霉素處理，對(duì)照組加入1% DMSO，作用48 h 后，消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，棄上清，加入200 μL 試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，分別加入10 μL Annexin V－FITC和5 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min，再加入300 μL 結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

5 ΔΨm、ROS 和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(［Ca2+］i)的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/Glv 細(xì)胞，以2 ×105cells/well 接種至12 孔板，加入0.2 μmol/L 鹽霉素處理，在6 h、12 h、24 h 時(shí)收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 遍。500 μL JC－1(10 mg/L)重懸細(xì)胞檢測(cè)ΔΨm，500 μL DCFH－DA (5 μmol/L)重懸細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS，10 μmol/L 熒光染料Fluo－3AM 檢測(cè)［Ca2+］i濃度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

6 檢測(cè)caspase－3、caspase－8 和caspase－9 活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/Glv 細(xì)胞，以2 ×105cells/well 的密度接種至12 孔板，加入鹽霉素0.2 μmol/L，分別處理0、12、24 h，按照試劑盒說(shuō)明收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌后重懸于細(xì)胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃下10 000 ×g 離心10 min，取上清加入顯色底物(caspase－3 底物Ac－DEVD－pNA、caspase－8底物Ac－IETD－pNA 和caspase－9 底物Ac－LEHD－pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96 孔板中，每組5 個(gè)復(fù)孔，避光孵育4 h，在405 nm 處檢測(cè)A 值。

7 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞色素C、Bcl－2、Bax、β－catenin 和磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(phosphorylated low－density lipoprotein receptor－related protein 6，p－LRP6)的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/Glv 細(xì)胞，分別以0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L 鹽霉素處理48 h，收集細(xì)胞PBS 洗2 遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白。取蛋白50 μg，經(jīng)10% SDS－PAGE 電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，鼠抗人細(xì)胞色素C、Bcl－2、Bax、β－catenin 抗體(Santa Cruz)、p－LRP6(Ser1490)抗體(Cell Signaling Technology)或β－actin 抗體(Chemicon International)4 ℃孵育過(guò)夜，1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法觀察蛋白的表達(dá)。目的條帶用Image－Pro Plus 分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以β－actin 內(nèi)參照校正。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞增殖的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用

結(jié)果顯示，0.1 ～1.6 μmol/L 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞生長(zhǎng)呈劑量依賴(lài)性抑制作用，0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 μmol/L 鹽霉素細(xì)胞增殖抑制率分別為(89.56 ± 2.30)%、(28.70 ± 2.31)%、(53.77 ±3.02)%、(75.98 ±3.30)%和(89.56 ±3.43)%，與對(duì)照組比較差異顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1A。計(jì)算得IC50=0.37 μmol/L。0.2 μmol/L 鹽霉素處理K562/Glv 細(xì)胞24 h 時(shí)即顯示明顯細(xì)胞增殖抑制作用，抑制率為(14.78 ±2.24)%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越來(lái)越明顯，72 h 細(xì)胞抑制率為(43.86 ±2.31)%，96h為(55.34 ±3.42)%，見(jiàn)圖1B。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示0.2 μmol/L 鹽霉素能夠誘導(dǎo)K562/Glv 細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)明顯亞G1二倍體峰，且隨著時(shí)間的增加，作用越明顯，48 h 細(xì)胞凋亡率為(15.66 ±2.23)%，對(duì)照組及DMSO 組凋亡率分別為(5.63 ±1.47)%和(5.70 ±1.48)%，見(jiàn)圖2。

2 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞ΔΨm、ROS 和［Ca2+］i的影響

結(jié)果顯示，0.2 μmol/L 鹽霉素作用K562/Glv細(xì)胞，ΔΨm在6 h 時(shí)即顯著下降，24 h 時(shí)下降至最低，為對(duì)照組的(47.5 ±2.3)%;細(xì)胞內(nèi)ROS 在6 h時(shí)已顯著升高，24 h 時(shí)仍然高于對(duì)照組水平(144.7±4.5)%;［Ca2+］i在6 h 時(shí)已顯著升高，為對(duì)照組的(163.6 ± 5.6)%，24 h 時(shí)下降至接近對(duì)照組水平。

Figure 1. Inhibitory effect of salinomycin on Gleevec－resistant chronic myeloid leukemia cell line K562/Glv.A:dose－effect relationship (48 h);B:time－effect relationship (0.2 μmol/L). ± s. n =5. * P ＜0.05 vs control (0 μmol/L or 0 h).圖1 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

Figure 2. Salinomycin induced apoptosis of K562/Glv cells.圖2 鹽霉素誘導(dǎo)K562/Glv 細(xì)胞凋亡

Figure 3. Effects of salinomycin on mitochondria membrane potential (ΔΨm)，reactive oxygen species(ROS)and intracellular Ca2+ concentration (［Ca2+］i)in K562/Glv cells. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control(0 h).圖3 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響

3 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞caspase－3、caspase－8和caspase－9 活性的影響

結(jié)果顯示，0.2 μmol/L 鹽霉素作用K562/Glv 細(xì)胞后，caspase－8 和caspase－9 活性在6 h 時(shí)已經(jīng)達(dá)到較高水平，而且之后仍然維持在這高水平;caspase－3 活性則隨著時(shí)間而增加，呈時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。這表明鹽霉素通過(guò)先激活caspase－8 和caspase－9，再激活caspase－3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Effects of salinomycin on activity of caspase－3，caspase－8 or caspase－9 in K562/Glv cells. ±s. n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control (0 h).圖4 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞caspase－3、caspase－8 或caspase－9 活性的影響

4 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞Bcl－2、Bax、細(xì)胞色素C、β－catenin 和p－LRP6 蛋白的影響

結(jié)果顯示，0.2 μmol/L 鹽霉素作用K562/Glv 細(xì)胞48 h，Bcl－2 表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)、Bax 表達(dá)則明顯增加，Bcl－2/Bax 比值顯著降低，同時(shí)胞漿細(xì)胞色素C顯著增加，β－catenin 和p－LRP6 蛋白水平也顯著下降，見(jiàn)圖5。結(jié)果說(shuō)明鹽霉素不僅通過(guò)Bcl－2/Bax和細(xì)胞色素C 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且通過(guò)K562/Glv 細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖。

Figure 5. Effects of salinomycin on the levels of cytochrome C，Bcl－ 2，Bax，β－catenin and p－LRP6 in K562/Glv cells. 1:control;2:salinomycin. ±s.n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 鹽霉素對(duì)K562/Glv 細(xì)胞Bcl－2、Bax、細(xì)胞色素C、β－catenin和p－LRP6 蛋白的影響

討 論

BCR－ABL 靶點(diǎn)特異藥物格列衛(wèi)是目前CML 治療的一線(xiàn)藥物，但是也不乏有臨床格列衛(wèi)耐藥的現(xiàn)象。殘留的LSC 及原始祖細(xì)胞，成為該疾病復(fù)發(fā)的主要因素［1，4－5］。所以，尋求新的治療方案以清除腫瘤干細(xì)胞、減少耐藥與復(fù)發(fā)仍然十分必要。

LSC 由Lapidot 等［6］在急性髓系白血病的研究中首先提出，具有與正常造血干細(xì)胞相同的特征，即自我更新、無(wú)限繁殖以及多向分化潛能。許多研究表明，Wnt/β－cfatenin 信號(hào)途徑在LSCs 中具有重要作用，解釋了傳統(tǒng)化療不能根除白血病的原因［1，7］。所以，尋找抑制該信號(hào)途徑并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡藥物進(jìn)行研究具有意義。

最近研究顯示，鹽霉素通過(guò)Wnt 信號(hào)途徑抑制慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［7］。鹽霉素屬于聚醚類(lèi)一元羧酸，由白色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是典型的離子載體抗生素，它對(duì)細(xì)胞中的陽(yáng)離子，尤其K+、Na+、Rb+的親和力特別強(qiáng)，使生物所必需的陽(yáng)離子通過(guò)膜上脂質(zhì)屏障的浸透性增強(qiáng)，妨礙細(xì)胞內(nèi)外陽(yáng)離子的傳遞，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而影響滲透壓，最終使細(xì)胞崩解，起到殺菌作用。

本研究結(jié)果顯示，鹽霉素不僅通過(guò)降低β－catenin 和p－LRP6 蛋白水平抑制耐格列衛(wèi)的K562/Glv細(xì)胞生長(zhǎng)，而且通過(guò)使ΔΨm下降、細(xì)胞色素C 和Ca2+的釋放，增加細(xì)胞內(nèi)ROS，以及激活caspase－3、－8 和－9，降低Bcl－2/Bax 比值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們推測(cè)其作用本質(zhì)可能與［Ca2+］i變化有關(guān)。Bcl－2 家族、線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C 及caspase 是細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路的基本成分，而［Ca2+］i變化對(duì)它們的活性狀態(tài)調(diào)節(jié)具有重要影響［9］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為改善慢性髓系白血病臨床治療方法提供新的依據(jù)。但如何應(yīng)用鹽霉素于該疾病的臨床治療還有待進(jìn)一步研究。

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