劉 敏， 張家明， 李 超， 郝海菊， 李景東

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心內科，湖北 武漢430022)

近年來在多種動物和人類發(fā)現(xiàn)心肌缺血預適應和后適應現(xiàn)象，即在心肌缺血前后給予多次短暫的缺血再灌注能減輕隨后的再灌注損傷，兩者具有內源性心肌保護作用，受到實驗和臨床研究的高度重視。由于臨床上心肌梗死的發(fā)生有一定程度的不可預知性，因而進行缺血后適應干預治療更具有應用前景［1］，但是其發(fā)生機制尚未闡明［2－3］。

研究表明，心肌缺血再灌注時可產生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF－α)等多種炎性細胞因子，細胞鈣超載等也參與細胞的損傷過程。鈣－鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium－calmodulin－dependent protein kinase II，CaMKII)是一種分布廣泛的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，介導的底物磷酸化和去磷酸化是細胞信號轉導過程中的重要環(huán)節(jié)，也是胞內代謝調節(jié)的最重要因素之一，通過磷酸化肌漿網(wǎng)鈣泵和受磷蛋白等在調節(jié)胞內鈣離子平衡過程中發(fā)揮重要作用［4］，但是目前有關缺血后適應對TNF－α 和CaMKⅡ的影響報道甚少［2－3］，本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷模型，觀察缺血后適應對心肌組織TNF－α 和CaMKⅡ水平變化的影響，并應用重組人腫瘤壞死因子受體:Fc 融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor:Fc fusion protein，rhTNFR:Fc)以中和缺血再灌注過程中產生的過量TNF－α，探討兩者在心肌缺血后適應中的作用和機制。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

成年SD 雄性大鼠重200 ～250 g，購自同濟醫(yī)學院實驗動物中心。TNF－α 及CaMKII－PThr287Ⅰ抗購自Cell Signaling Technology。CaMKII 及GAPDHⅠ抗購自Santa Cruz Biotechnology。相應的Ⅱ抗均購自武漢安特捷生物技術有限公司。ECL 發(fā)光試劑盒購自Amersham。Trizol、逆轉錄試劑盒及SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。rhTNFR:Fc 購自上海中信國健藥業(yè)有限公司。TNF－α 引物序列上游為5＇－CAAAACTGCAGTGACAAGCC－3＇，下游為5＇－GGACTCCGTGATGTCTAAGT－3＇;β－actin 引物序列上游為5＇－CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC－3＇，下游為5＇－ATGGAGCCACCGATCCACA－3＇，由武漢生命技術公司合成。伊文思藍購自Sigma。2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride，TTC)購自上海索萊寶生物科技有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

2 主要方法

2.1 缺血再灌注模型 SD 大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg濃度腹腔注射麻醉。將SD 大鼠固定于手術臺，氣管切開后接小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)，潮氣量按30 mL/kg 設定。于左側第3 ～4 肋間開胸暴露心臟，破心包膜。接BL－420F 生物機能實驗系統(tǒng)，平衡15 min。于左心耳根部下方2 mm 處用6－0 帶線縫合針盲扎左冠狀動脈前降支，將縫合線穿過橡膠管打一活結。心臟表面顏色呈蒼白、發(fā)紺，同時心電圖ST 段抬高提示結扎成功。結扎30 min后，打開活結，進行再灌注2 h。

2.2 實驗分組 將SD 大鼠分為5 組:假手術組(sham 組，n=16)，只分離左前降支，不結扎;缺血再灌注組(IR 組，n =16)，同2.1 方法;缺血后適應組(IP 組，n =16)，缺血30 min后，給予10 s 再灌注/10 s 缺血，共循環(huán)3 次，之后給予119 min 再灌注;rhTNFR:Fc+缺血再灌注組(F+IR 組，n=16)及rhTNFR:Fc+缺血后適應組(F +IP 組，n =16)，術前按1.75 mg/kg 腹腔注射rhTNFR:Fc，余步驟分別同缺血再灌注組和缺血后適應組。其中每組中的8 只心臟用于Western blotting和RT－PCR 檢測，其余的8 只用于測定心肌梗死面積。

2.3 心肌梗死面積測定 待再灌注2 h 結束后，永久性結扎左前降支，從升主動脈逆行性注射1 mL 1%伊文思藍，待整個心臟變藍后，迅速將其取出，放入PBS 溶液中清洗干凈，去除心房及右室。將處理后的心臟放入－20 ℃冰箱冷凍15 min 后取出，用刀片橫切成2 mm 薄片，再放入現(xiàn)配pH 7.4 的1%TTC 中孵育20 min，之后放入10%多聚甲醛中過夜。相機拍照后，用Image－Pro Plus 6.0 軟件測定心肌梗死面積、缺血區(qū)面積及總面積。

2.4 Western blotting 檢測 從－80 ℃冰箱中取出心臟，去除心房和右心室。肌漿網(wǎng)內和細胞內蛋白提取方法同文獻所述［5］。按照每孔50 μg 上樣，SDS－PAGE 電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉，然后Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。相應Ⅱ抗室溫孵育2 h 后，暗室中ECL 發(fā)光劑曝光。蛋白條帶相對濃度用Quantity One Software 軟件測定。

2.5 RT－PCR 檢測 取100 mg 左室前壁組織用Trizol 提取mRNA。用260 nm 吸光度值測定RNA 濃度。0.5 μg RNA 加入10 μL 混合液中，在37 ℃15 min 和85 ℃5 s 孵育進行逆轉錄過程。1 μL cDNA 加入10 μL 混合液中進行實時定量PCR 過程?；虮磉_量用StepOne Software2.1 軟件計算。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 缺血后適應及rhTNFR:Fc 對大鼠心肌梗死面積的影響

與sham 組比較，IR 組梗死面積/缺血區(qū)面積及缺血區(qū)面積/總面積的比值均顯著增加(P ＜0.01);與IR 組比較，IP 組以及F+IR 組和F+IP 組均顯著減少(P ＜0.01)，其中F+IP組的比值減少最明顯，見圖1、2。

Figure 1. The ratio of infarct area to ischemic area in the five groups. ±s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖1 各組心肌梗死面積/缺血面積的比值

Figure 2. The ratio of ischemic area to total area in the five groups. ±s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖2 各組心肌缺血面積/總面積的比值

2 各組心肌組織TNF－α 表達的變化

與sham 組比較，其余各組TNF－α 蛋白表達均顯著升高(P ＜0.01);與IR 組比較，IP 組以及F +IR 組和F +IP 組均顯著降低(P ＜0.01)，其中F +IP 組降低最明顯，見圖3。心肌組織TNF－α mRNA 表達相對量如圖4 所示，與TNF－α蛋白表達檢測結果一致。

3 各組心肌組織CaMKⅡ蛋白表達和活性的變化

心肌組織CaMKⅡ蛋白表達如圖5 所示，與sham 組比較，IR、IP、F+IR 組及F +IP 組均顯著降低(P ＜0.01)。與sham 組比較，IR 組p－CaMK Ⅱ蛋白表達顯著降低(P ＜0.01);與IR 組比較，IP 組、F +IR 組和F +IP 組均明顯升高(P ＜0.01)，其中以F+IP 組升高最為顯著，見圖6。

討 論

Figure 3. The relative expression of TNF－α protein in the five groups. ±s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖3 各組TNF－α 蛋白表達的相對量

Figure 4. The relative expression of TNF－α mRNA in the five groups. ± s. n =8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖4 各組TNF－α mRNA 表達的相對量

Figure 5. The protein expression of CaMKⅡ. ±s.n = 8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F+IR.圖5 各組CaMKⅡ蛋白的表達

Figure 6. The protein expression of p－CaMKⅡ. ±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs IR;##P ＜0.01 vs IP;△△P ＜0.01 vs F +IR.圖6 各組p－CaMKⅡ蛋白的表達

近年發(fā)現(xiàn)，在多種動物和人類存在心肌缺血后適應對心臟的保護作用，其發(fā)生機制包括減少氧自由基的產生和細胞內鈣超載、減輕內皮功能失調等被動機制以及主動激活再灌注損傷保護激酶和其它蛋白激酶而產生保護作用，但尚未完全闡明［2－3］。目前認為，缺血再灌注損傷涉及一系列多因素參與的復雜病理生理過程，包括細胞因子參與的炎癥反應、氧自由基、細胞內鈣超載等因素引起細胞、亞細胞結構甚至基因的損傷。研究表明，急性缺血再灌注可導致心肌自分泌和釋放TNF－α［6］，TNF－α 能誘導氧化應激，后者激活NFkappa B 轉位［7］，在炎癥反應損傷過程中發(fā)揮重要作用［8－9］，另一方面，在心肌缺血預適應過程中對心肌具有保護作用［10－11］。TNF－α 對心肌損傷和保護的雙重作用，表現(xiàn)為濃度和時間依賴性并且與TNF－α 作用的受體類型有關，即TNF－α 在高濃度時主要與TNFR1 受體結合加重細胞損傷，而在低濃度時主要與TNFR2 受體結合發(fā)揮保護作用［9，12］。但是TNF－α 在心肌缺血后適應中的作用目前尚不清楚［3，11］，因此本研究通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，觀察到缺血再灌注組心肌梗死面積、心肌組織TNF－α 含量較對照組明顯增加，而缺血后適應組較缺血再灌注組和對照組均明顯減少，提示缺血后適應的心肌保護作用可能與缺血后適應減少TNF－α 的產生有關。Kin 等［7］也觀察到，缺血后適應能抑制大鼠心肌氧化應激反應介導的NF－kappa B 轉位和TNF－α 釋放從而減輕細胞凋亡。

為證實上述推測，我們應用重組人腫瘤壞死因子受體融合蛋白rhTNFR:Fc 以中和缺血再灌注過程中產生的高濃度TNF－α，結果顯示，心肌梗死面積在rhTNFR:Fc 并缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯減少，提示通過應用rhTNFR:Fc 降低TNF－α 含量可減少心肌梗死面積，支持缺血后適應可能同樣通過減少TNF－α 的產生而發(fā)揮心肌保護作用的推斷。其機制可能通過降低缺血再灌注時高濃度的TNF－α 到較低水平，一方面減少與TNFR1 受體的結合從而減輕損傷反應，另一方面通過與TNFR2 受體結合發(fā)揮保護作用，這有待進一步證實。本研究還觀察到，心肌梗死面積在rhTNFR:Fc 并缺血后適應組較rhTNFR:Fc 并缺血再灌注組以及缺血后適應組均有進一步減少，提示聯(lián)合應用rhTNFR:Fc 和缺血后適應能增強缺血后適應的心肌保護作用，并且效果優(yōu)于二者單用。

細胞內鈣超載是缺血再灌注損傷的病理生理機制之一［8］，肌漿網(wǎng)在調節(jié)胞內鈣離子濃度方面發(fā)揮重要作用，在心肌缺血再灌注時肌漿網(wǎng)功能失調，肌漿網(wǎng)CaMKⅡ活性降低［13］。CaMKⅡ的活性主要受Ca2+和鈣調蛋白調節(jié)，激活的CaMKⅡ通過多種途徑調節(jié)細胞內Ca2+平衡。已有研究表明CaMKⅡ的激活可以磷酸化肌漿網(wǎng)中多種蛋白質，包括肌漿網(wǎng)鈣泵、受磷蛋白和蘭尼堿受體等，通過磷酸化這些蛋白質調節(jié)肌漿網(wǎng)鈣離子平衡，但目前尚不清楚缺血后適應是否對心肌胞內CaMKⅡ含量和活性存在影響［3，14］。本研究觀察到心肌缺血再灌注組肌漿網(wǎng)CaMKⅡ含量和活性較假手術組均降低，這與先前的報道一致［9］;缺血后適應組、rhTNFR:Fc 并缺血再灌注組及rhTNFR:Fc 并缺血后適應組CaMKⅡ含量也較假手術組均降低，提示缺血后適應以及應用rhTNFR:Fc 不能完全消除缺血再灌注降低CaMKⅡ含量的作用。但是缺血后適應能減輕缺血再灌注時CaMKⅡ活性降低的程度，從而維持CaMKⅡ活性接近正常水平，有利于肌漿網(wǎng)多種蛋白質的磷酸化，發(fā)揮肌漿網(wǎng)對鈣離子攝取和釋放的功能，以維持胞內鈣穩(wěn)態(tài)，減輕缺血再灌注時鈣超載的發(fā)生，這與Osada等［15］有關缺血預適應能維持缺血再灌注時肌漿網(wǎng)CaMKⅡ活性的報道一致，表明肌漿網(wǎng)CaMKⅡ在心肌缺血后適應的過程中起重要作用。

重組人腫瘤壞死因子受體融合蛋白可以特異性地與TNF－α 結合，從而阻斷TNF－α 與其受體的相互作用，目前已有效用于治療多種炎癥性疾病［16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低劑量TNF－α 對組織細胞具有一定的保護作用，而大劑量TNF－α 引起組織細胞損害，最近有報道不同劑量TNF－α 對肺微血管內皮細胞Nrf2 轉錄調節(jié)活性產生不同影響［17］。本研究結果顯示，心肌缺血后適應時，TNF－α 含量降低，CaMKⅡ活性明顯增強，在應用rhTNFR:Fc 中和TNF－α 后，CaMKⅡ活性進一步增強，其機制可能是心肌缺血區(qū)TNF－α 降低到適度水平主要與TNFR2 受體結合［6，9］，引起細胞內鈣離子輕度增加［18］，能有效激活多種鈣離子依賴蛋白酶，包括CaMKⅡ、ERK、MSKI、cPLA2、PKC 等。

本研究尚存在一定局限性，包括未直接觀察心肌組織不同的TNF－α 水平對TNFR1 受體和TNFR2 受體功能以及CaMKⅡ含量和活性的影響，如能敲除或者沉默CaMKⅡ基因和TNFR2 基因、在后適應前給予CaMKⅡ抑制劑則更能說明CaMKⅡ的作用，這些有待繼續(xù)研究。

(致謝:在實驗過程中，劉學剛碩士、楊勇博士提供了技術方面的幫助并提出了建設性意見，在此表示感謝。)

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