王 波 張 華 盧康平

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)六科，黑龍江哈爾濱 150040

膜聯(lián)蛋白Ⅰ（AnnexinⅠ）屬于膜聯(lián)蛋白家族中的成員之一，又被稱為Annexin A（Annexin-1，Anx-1），屬于鈣離子依賴的磷脂蛋白超家族，是第一個(gè)被鑒定的Annexins家族成員。AnnexinⅠ是表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）絡(luò)氨酸激酶磷酸化的底物，能在上游特異性的調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號控制的激酶級聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)還參與細(xì)胞信號的傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與間質(zhì)之間的相互作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)[1]。大量證據(jù)表明，不同組織來源的正常的及其腫瘤組織中的乳腺癌、前列腺癌、大腸癌、肝癌等均有AnnexinⅠ表達(dá)，AnnexinⅠ在多種腫瘤中的表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性分布[2]，可能與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性。但AnnexinⅠ蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)性研究不多，本研究應(yīng)用免疫組化分析AnnexinⅠ在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)，評價(jià)AnnexinⅠ表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，探討AnnexinⅠ在肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 ?標(biāo)本收集

收集2004年1月～2006年12月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科存檔的79例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的手術(shù)組織標(biāo)本。本研究79例患者中，男41例，女38例；年齡＜40歲23例，≥40歲56例；鱗癌39例，腺癌40例；淋巴結(jié)受侵組46例，無淋巴結(jié)受侵組33例；（Ⅰ+Ⅱ）期28例，（Ⅲ+Ⅳ）期51例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療及靶向治療。本研究得到哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法

兔抗人AnnexinⅠ多克隆抗體和免疫組化檢測試劑盒，分別購自美國Zymed實(shí)驗(yàn)室和北京中杉公司。采用免疫組織化學(xué)法將79例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本均進(jìn)行AnnexinⅠ（1∶150）免疫組織化學(xué)染色。染色方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，AnnexinⅠ陽性切片作為陽性的對照。

1.3 結(jié)果判定

AnnexinⅠ的陽性染色均以腫瘤細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒時(shí)為陽性表達(dá)，以染色強(qiáng)度和陽性的細(xì)胞數(shù)比例來評定陽性表達(dá)。結(jié)果判定在雙盲方法下進(jìn)行，每張切片在光鏡下隨機(jī)的被選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞100個(gè)，染色強(qiáng)度分為：無色（－）為0分，淺黃色（+）為1分，黃色或更深顏色（++）為2分。陽性細(xì)胞數(shù)分級：≤50%為0分，51～75%為1分，＞75%為2分。上面兩項(xiàng)得分乘積結(jié)果≥2分則為陽性病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在79例非小細(xì)胞肺癌組織中，有40例為AnnexinⅠ高表達(dá)（50.6%），其中鱗癌為包膜表達(dá)，腺癌為包膜或胞漿均有表達(dá)，以包膜表達(dá)為主。見圖2、3。非小細(xì)胞肺癌組織中AnnexinⅠ的表達(dá)情況與肺癌患者淋巴結(jié)受侵相關(guān)（P=0.022，P＜0.05），而與患者的性別、年齡、病理類型及分期之間的關(guān)系不明顯（P＞0.05）。見表1。淋巴結(jié)受侵組的AnnexinⅠ的陽性表達(dá)組的平均疾病進(jìn)展時(shí)間為5.1個(gè)月，AnnexinⅠ陰性表達(dá)組的平均疾病進(jìn)展時(shí)間為6.3個(gè)月，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。其中47例病例可評價(jià)明確的疾病進(jìn)展時(shí)間，在這些病例中，AnnexinⅠ的陽性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者的疾病進(jìn)展時(shí)間的關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示AnnexinⅠ參與到腫瘤惡化的生物學(xué)進(jìn)展中。

表1 非小細(xì)胞肺癌中膜聯(lián)蛋白Ⅰ的表達(dá)與病理因素的關(guān)系（例）

3 討論

圖1 生存分析

圖2 膜聯(lián)蛋白Ⅰ在肺鱗癌組織中的表達(dá)（SP法，×400）

圖3 膜聯(lián)蛋白Ⅰ在肺腺癌組織中的表達(dá)（SP法，×400）

AnnexinⅠ屬于鈣離子的磷脂依賴蛋白超家族成員，基因定位于人類染色體9q11～9q12上，其長度至少有19 kbp，內(nèi)含有13個(gè)外顯子，分子量35～40 KD，每個(gè)外顯子長度不等，從57～123 kb，被113 bp～55 kbp內(nèi)含子隔斷，此蛋白是表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶的磷酸化的底物，在細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等方面有著重要的調(diào)節(jié)作用，可能與AnnexinⅠ所介導(dǎo)的多種生物學(xué)的特征有關(guān)[3-4]。有研究檢測了AnnexinⅠ在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶，尤其在Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽性表達(dá)高達(dá)48%，高達(dá)提示了AnnexinⅠ與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。有研究AnnexinⅠ在正常乳腺導(dǎo)管上皮不表達(dá)，在乳腺良性腫瘤中的表達(dá)率很低，而在各種組織學(xué)類型不同的乳腺癌中卻表現(xiàn)出很高的表達(dá)率，同時(shí)在轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例中的表達(dá)率明顯高于乳腺癌無轉(zhuǎn)移的病例，表明AnnexinⅠ與乳腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[6]。也有研究顯示，在大腸癌轉(zhuǎn)移組中AnnexinⅠ蛋白的表達(dá)較無轉(zhuǎn)移組的高，表達(dá)有顯著的差異，提示大腸癌的臨床分期越高，則AnnexinⅠ的蛋白表達(dá)率越高，AnnexinⅠ的表達(dá)和大腸癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[7]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ在肺鱗癌中的表達(dá)，陽性率53.8%，在肺腺癌中也呈現(xiàn)表達(dá)，陽性率47.5%，且發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ在有淋巴結(jié)受侵的組織中的陽性表達(dá)，提示了AnnexinⅠ與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。對AnnexinⅠ的表達(dá)與肺癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后顯示，AnnexinⅠ的表達(dá)與患者的年齡，性別，組織學(xué)類型及組織分期無顯著相關(guān)性，而與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的AnnexinⅠ中的表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移組的。筆者的研究結(jié)果顯示，AnnexinⅠ可能對非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起到一定的促進(jìn)作用?？赡芘c肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，AnnexinⅠ同時(shí)參與到腫瘤惡化的生物學(xué)進(jìn)展中，有望成為肺癌早期診治的理論依據(jù)。表皮生長因子受體（EGFR）在所有的表皮細(xì)胞以及基質(zhì)中表達(dá)。這里指出附加的調(diào)節(jié)器或骨架膜組織和膜流量調(diào)節(jié)的分布的表皮生長因子受體在細(xì)胞膜，它包括膜聯(lián)蛋白，鈣依賴性膜結(jié)合蛋白家族，與脂質(zhì)筏形成，有可能影響表皮生長因子受體定位[8]。膜聯(lián)蛋白是另一類高度保守的鈣調(diào)節(jié)蛋白。雖然結(jié)構(gòu)明確，但其確切的功能尚不完全清楚，但在最近幾年已取得科相當(dāng)大的進(jìn)展。一些的膜聯(lián)蛋白發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞膜，特別是Annexin 1，Annexin 2，Annexin 6和Annexin 8似乎參與了EGFR受體信號的調(diào)節(jié)[8]。一些研究顯示，AnnexinⅠ在生長抑制中的作用，而其他研究表明AnnexinⅠ的惡性轉(zhuǎn)化與AnnexinⅠ的表達(dá)水平有關(guān)[9]。然而AnnexinⅠ是否影響EGFR受體的轉(zhuǎn)運(yùn)和在體內(nèi)的信號目前還不清楚，但AnnexinⅠ的調(diào)節(jié)表皮生長因子受體的功能已經(jīng)在肝再生及腫瘤中被顯示[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，對絲裂霉素、聚乙二醇脂質(zhì)體鹽酸多柔比星、阿霉素及長春新堿的乳腺癌細(xì)胞系已檢測到AnnexinⅠ的表達(dá)顯著升高[11]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對多種藥物耐受的白血病細(xì)胞系K562中出現(xiàn)了AnnexinⅠ表達(dá)顯著升高[12]。而AnnexinⅠ在肺癌細(xì)胞系中表達(dá)及與耐藥之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究和探討。

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