邱建永 王洛臨 李智勇 張建軍 許曼嬌

1.廣東省第二中醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)研究所制劑研究室，廣東廣州 510095；3.廣東省第二中醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510095

桑麻合劑是廣東省第二醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑，由桑白皮、紫菀、甘草等12味藥組成，具有清熱宣肺、化痰止咳的功效，主要用于風(fēng)熱咳嗽癥狀。臨床上以湯劑煎服，療效確切。黃酮類成分為方中多味藥材的主要藥效成分之一[1-2]，因此，本研究選用總黃酮含量和干浸膏得量作為評價指標(biāo)，采用正交設(shè)計法和單因素優(yōu)選法，分別優(yōu)選其提取工藝和純化工藝，以便更好地發(fā)揮該制劑的療效。

1 儀器與試藥

UV22501PC型可見分光光度計（島津），Bp211D電子分析天平（德國，sartorius）。蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200306）。桑麻合劑所用藥材均由廣東廣弘藥業(yè)有限公司購得，經(jīng)畢曉黎副主任中藥師鑒定為正品；所用化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)選

2.1.1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇影響提取因素的料液比、提取時間、提取次數(shù)，進(jìn)行優(yōu)選，其因素水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平表

2.1.2 供試品溶液的制備

按處方比例，稱取桑白皮、紫菀、甘草等12味藥材共9份，每份136.6 g，按正交試驗設(shè)計表L9（34）安排，分別提取，過濾，濾液分別濃縮并定容至200 mL。測定干浸膏含量和總黃酮含量。

2.1.3 干膏含量的測定

精密吸取各樣品濃縮液25 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照干燥失重測定法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅨG）測定，計算干膏得量。

2.1.4 總黃酮含量測定[4]

2.1.4.1 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取6 mg蘆丁，精密稱定，加95%乙醇定容至50 mL，得0.12 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照液。

2.1.4.2 測定波長的確定 精密移取蘆丁對照溶液10 mL置25 mL容量瓶中，振蕩搖勻后，加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻靜置6 min，再加4.3%氫氧化鈉10 mL，搖勻后，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻放置15 min，以95%乙醇調(diào)零，從400 nm至600 nm進(jìn)行全波長掃描，測得503 nm處有最大吸收，因此，以503 nm為測定波長。

2.1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[4] 精密吸取上述對照品溶液2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶，分別加蒸餾水稀釋至10 mL，振蕩搖勻后，自“加入5%亞硝酸鈉1 mL”起，同測定波長的確定法操作，以試劑作空白，于503 nm下測定吸光值，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：C=0.078 5A-0.000 3（r=0.998 7）。結(jié)果表明蘆丁對照品在0.009 6～0.096 0 mg/mL呈線性關(guān)系。

2.1.4.4 供試品溶液的制備與測定 精密吸取提取液2 mL，加蒸餾水定容至50 mL，搖勻，精密吸取稀釋液1 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至10 mL，按上述方法操作顯色，計算總黃酮含量。

2.1.4.5 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液0.6mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作顯色，平行測定6次，結(jié)果RSD=0.27%，表明精密度良好。

2.1.4.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取上述供試品溶液0.6 mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作顯色，分別放置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，測定各時間點的吸光度，結(jié)果RSD=1.79%，表明供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.7 重復(fù)性試驗 精密吸取供試品溶液各0.6 mL，置10 mL量瓶中，按上述方法操作顯色，測定吸光度，結(jié)果RSD=2.31%，表明重復(fù)性良好。

2.1.4.8 加樣回收率測定 精密稱取已知黃酮含量的供試品5份，分別加入蘆丁對照品適量，按上述方法操作顯色，測定吸光度，計算回收率為98.9%，RSD=0.91%。說明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理與工藝優(yōu)選

用綜合加權(quán)評分法，以干浸膏得量和總黃酮含量的9次試驗的最大值為100分，將各指標(biāo)成分的總量分別轉(zhuǎn)換為評分值，總固體得量的加權(quán)系數(shù)為0.4，總黃酮含量的加權(quán)系數(shù)為0.6，將每次試驗的各指標(biāo)成分的評分值乘以相應(yīng)的加權(quán)系數(shù)后求和，得綜合評分值，以綜合評分值計算正交試驗結(jié)果，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2、3。

表2 正交試驗結(jié)果表

表3 方差分析表

結(jié)果表明：由直觀分析可知因素主次為提取次數(shù)（C）＞液料比（A）＞提取時間（B）。方差分析表明，因素A和因素C對試驗結(jié)果有顯著影響，因素B對試驗結(jié)果無影響。因此，提取工藝條件定為：處方藥材加水提取3次，每次加8倍量水，提取1.0 h，即A2B1C3。

2.1.6 提取工藝驗證

按處方比例，稱取藥材3份，每份136.6 g，按正交試驗結(jié)果的最佳工藝條件重復(fù)試驗3次，結(jié)果表明：干浸膏得量分別 為：34.80、34.51、33.09 g，總 黃 酮 含 量 為2.254、2.268、2.205 g，平均綜合評分值為96.020。與正交試驗最大綜合評分值接近，提示優(yōu)選的工藝穩(wěn)定。

2.2 純化工藝優(yōu)選

2.2.1 藥液含醇量的確定

取按上述提取條件制備的浸膏（浸膏-藥材比為1∶1）3份，每份273.2，分別加乙醇至表4所示藥液含醇量，冷藏靜置24 h，取濾過，濾液回收乙醇，并定容至200 mL。分別照上述方法測定濾液固形物含量和總黃酮含量，剩余濾液回流煮沸30 min，冷藏放置24 h，觀察藥液澄明度，結(jié)果見表4。

表4 藥液含醇量對純化的影響

結(jié)果表明：純化藥液含醇量為70%，可滿足本品制成合劑的要求。

2.2.2 濃縮液相對密度的確定

取按上述提取條件制備的浸膏（浸膏-藥材比為1∶1）4份，每份273.2 g，分別濃縮并加水調(diào)整至表5所示濃縮比，混勻，用密度計測定60℃時濃縮液的相對密度，濃縮液分別加乙醇至藥液含醇量70%，冷藏24 h，濾過，濾液回收乙醇并定容至200 mL，測定各濃縮液中總黃酮含量，結(jié)果見表5。

表5 藥液濃縮比對純化的影響

結(jié)果表明：濃縮至相對密度為1.05～1.10（60℃）比較合理。

3 討論

由于部分黃酮類成分具有易溶于乙醇和熱水的特點，在含量測定過程中，濃縮液出現(xiàn)沉淀應(yīng)充分搖勻后迅速取樣，否則易造成測定結(jié)果的偏差。

中藥復(fù)方藥效成分復(fù)雜，作用靶點尚不清晰，因此，本制劑選擇用水提取的工藝，更符合原湯劑合煎有效的特點。提取工藝篩選以總黃酮含量和干浸膏得量為評價指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，鑒于總黃酮含量比干浸膏得量能更好地反映藥物提取情況，故在設(shè)計權(quán)重系數(shù)時，總黃酮含量權(quán)重系數(shù)較大，二者的權(quán)重系數(shù)設(shè)計為6∶4，這樣相對合理些。經(jīng)正交試驗驗證結(jié)果表明，優(yōu)選的提取工藝參數(shù)穩(wěn)定，可行。

本制劑純化工藝采用了傳統(tǒng)的乙醇沉淀工藝，試驗分別對藥液含醇量和濃縮液的相對密度兩個重要的影響因素進(jìn)行篩選，經(jīng)穩(wěn)定性考察，優(yōu)選出的最佳醇沉工藝穩(wěn)定，可滿足本合劑對澄明度的要求。

[1]楊樂，陳泣.桑白皮研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，19（3）：98-100.

[2]侯海燕，陳立，董俊興.紫菀化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41（3）：161-163.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄Ⅵ30.

[4]劉齊林，李雪婷，王沛，等.正交設(shè)計優(yōu)選痛風(fēng)寧的最佳提取工藝[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（5）：959-960.

[5]于村，俞莎，沈向紅.中草藥總黃酮的提取和含量測定[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2002，14（7）：81-82.