張 鑫 陳瀏丹 侯 穎 王大南 王 歡 呂昌龍

1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遼寧沈陽 110001；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽 110042

大蒜含有豐富的營養(yǎng)成分和藥理活性成分。藥理和臨床證實(shí)大蒜有抗菌消炎、殺蟲、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能等作用[1-2]，其中最重要的有效成分是大蒜素[3]。

近年來日本學(xué)者在控制濕度和溫度的情況下，普通的鮮大蒜（白色）可以經(jīng)過處理轉(zhuǎn)化為黑大蒜。黑大蒜去除了大蒜的異味，帶有甜味，口感好，無需再經(jīng)處理即可直接食用。但黑大蒜在上述功能方面是否優(yōu)于鮮大蒜，目前尚不清楚。已有研究報道黑大蒜較鮮大蒜含有更多的氨基酸、有機(jī)硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸[4]。筆者前期研究已證明黑大蒜提取物對免疫功能有促進(jìn)作用[5]。本文則就黑大蒜提取物和鮮大蒜提取物對免疫功能的影響進(jìn)行了比較研究，可為黑大蒜的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)一步提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57/BL-6小鼠6～7周，雌性，體重18～22 g，75只，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司（實(shí)驗(yàn)動物使用許可號：SCXK（滬）2007-0005）。

1.2 主要試劑

RPMI 1640（Thermo），LDH底物（NBT購自Sigma公司，NAD購自中國科學(xué)院生物研究所，乳酸鈉購自上海試劑三廠，PMS購自Fluka公司），NP-40（Fluka公司），Griess反應(yīng)液（Wako），IL-4，IL-17（EB），IL-2，IFN-γ和TNF-αELISA kit（R&D）。

1.3 黑大蒜和鮮大蒜提取物溶液的制備

1.3.1 黑大蒜提取物溶液的制備 黑大蒜粉由日本弘前大學(xué)佐佐木甚一教授提供。黑大蒜提取物按文獻(xiàn)[2]的方法制備，即取一定量的黑大蒜粉加適量的無熱源蒸餾水，100℃，煮沸2 h，自然冷卻后4層紗布過濾，濾過液于4 000 r/min離心30 min，取上清，經(jīng)冷凍干燥后即為黑大蒜提取物。臨用時用生理鹽水配成1 mg/mL溶液。

1.3.2 鮮大蒜提取物溶液的制備 制備方法與黑大蒜提取物溶液相同。取新鮮鮮大蒜去皮，研磨成蒜泥，低溫干燥成粉。再按上述方法加熱提取、冷凍干燥，再用生理鹽水配制成1 mg/mL鮮大蒜提取物溶液。

1.4 動物分組與處理

將上述75只C57/BL-6小鼠隨機(jī)分為15組，每組5只，第1～7組為黑大蒜組，第8～14組為鮮大蒜組，第15組為正常對照組。正常對照組每天腹腔注射0.1 mL生理鹽水，第1～7組每天腹腔注射黑大蒜提取物溶液0.1mL，第8～14組每天腹腔注射鮮大蒜提取物溶液0.1 mL。連續(xù)注射5 d，于末次注射后的第1～7天，從第1和第8組開始，每天處死兩組（黑大蒜和鮮大蒜處理的各一組）小鼠，第15組小鼠于末次注射后第7天處死。

1.5 樣品的采集

常規(guī)無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL，一部分用于NK細(xì)胞殺傷活性的檢測，另一部分細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，每孔接種0.5 mL，37℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)48 h。收集上清液用于NO，IL-2，IL-4，IL-17，IFN-γ和TNF-α分泌水平的測定。

1.6 NK細(xì)胞殺傷活性的測定

采用LDH釋放法檢測NK細(xì)胞殺傷活性[6]。

1.6.1 靶細(xì)胞的制備 取24～48 h培養(yǎng)的生長旺盛的Yac-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用PBS洗滌3次，1 000 r/min離心6 min，棄上清，用10% FBS-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL備用。

1.6.2 效應(yīng)細(xì)胞制備 上述制備脾細(xì)胞懸液（1×107/mL）為待測的效應(yīng)細(xì)胞。

1.6.3 NK細(xì)胞活性測定 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加靶細(xì)胞懸液0.1 mL，實(shí)驗(yàn)組每孔加效應(yīng)細(xì)胞懸液0.1 mL，自然釋放組每孔加RPMI-1640液0.1 mL代替效應(yīng)細(xì)胞，最大釋放組每孔加0.1 mL 1%NP-40于靶細(xì)胞中，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，每孔加0.05 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，1 500 r/min離心10 min，每孔取上清0.1 mL加LDH底物混合液0.1 mL作用20 min，每孔加入30μL終止液，490 nm濾光片測OD（吸光度）值，計算NK活性。NK細(xì)胞活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-自然釋放對照組OD值）/（最大釋放對照組OD值-自然釋放對照組OD值）×100%。

1.7 脾細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO水平的測定

采用Griess方法測定NO水平[7]。

1.7.1 第一步 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清加入96孔培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，每個樣品設(shè)2個復(fù)孔。

1.7.2 第二步 將100μmmol/L NaNO2溶液倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5μmmol/L等7個濃度，作為參考標(biāo)準(zhǔn)品用于定量測定。

1.7.3 第三步 每孔100μL Griess試劑，室溫10 min，酶標(biāo)儀550 nm處測量OD值。

1.7.4 第四步 以標(biāo)準(zhǔn)品測得OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣品的NO2-含量。

1.8 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17含量測定

用雙抗體夾心ELISA法按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-4的含 量，酶標(biāo) 儀 檢測450 nm處OD值。應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞因子含量（pg/mL）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS for windows 16.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞殺傷活性的檢測結(jié)果

在連續(xù)5 d給予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物與鮮大蒜提取物后，與正常對照組[（2.81±0.21）%]比較，黑大蒜和鮮大蒜處理后3～5 d NK細(xì)胞殺傷活性均顯著高于正常對照組；黑大蒜處理后第4天NK細(xì)胞殺傷活性最高，達(dá)（9.87±0.50）%，隨后逐漸下降；鮮大蒜組于處理后的第5天NK細(xì)胞殺傷活性最高，為（4.91±0.24）%。黑大蒜組處理后第4天和第5天均顯著高于鮮大蒜組（P<0.001或P<0.01）。見圖1。

圖1 黑大蒜組與鮮大蒜組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的比較

2.2 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO產(chǎn)生的檢測結(jié)果

與正常對照組（9.20±0.42）μmmol/L比較，黑大蒜組和鮮大蒜組于大蒜提取物處理后的第4～7天，小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO2-水平均顯著升高（P<0.05）。黑大蒜組NO2-水平于第5天（18.38±0.74）μmmol/L，第6天（24.94±2.21）μmmol/L和第7天（31.10±1.45）μmmol/L也顯著高于鮮大蒜組第5天[（16.42±1.18）μmmol/L]，第6天[（19.58±0.86）μmmol/L]，第7天[（22.65±1.85）μmmol/L]（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。見圖2。

圖2 黑大蒜組與鮮大蒜組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清NO分泌水平的比較

2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的檢測結(jié)果

在給予小鼠連續(xù)5 d注射黑大蒜與鮮大蒜提取物后，正常對照組IL-2的分泌水平（10.15±1.04）pg/mL，黑大蒜組的IL-2分泌水平明顯高于正常對照組，于第6天達(dá)到峰值[（16.06±0.67）pg/mL]，顯著高于鮮大蒜[（10.77±1.47）pg/mL]（P<0.001）。而鮮大蒜組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；黑大蒜和鮮大蒜組IFN-γ的分泌水平自末次處理后第1天開始就顯示高于正常對照組[（19.91±1.94）pg/mL]，于第4天達(dá)到高峰，分別為（41.33±3.08）pg/mL和（32.15±2.67）pg/mL。黑大蒜組于第4～5天顯著高于鮮大蒜組（P<0.01或P<0.05）；黑大蒜和鮮大蒜組TNF-α的分泌水平自末次處理后第1天開始就顯示高于正常對照組[（13.54±1.91）pg/mL]，均于第3天達(dá)高峰，分別為（53.98±6.97）pg/mL和（38.46±5.28）pg/mL。末次處理后第1～3天黑大蒜組顯著高于鮮大蒜組（P<0.05）；黑大蒜組和鮮大蒜組IL-17的分泌水平均于末次處理后第5天達(dá)高峰，分別為（21.29±1.83）pg/mL和（14.55±2.59）pg/mL，前者顯著高于后者（P<0.01）。二者均明顯高于正常對照組[（11.75±0.81）pg/mL]；黑大蒜組和鮮大蒜組IL-4的分泌水平于末次處理后1周與正常對照組（12.75±1.53）pg/mL比較均未見差異。末次處理后第3、4、5天雖顯示黑大蒜組[分別為（10.33±0.78），（10.85±1.49），（11.44±2.99）pg/mL]高于鮮大蒜組[分別為（9.58±1.88），（10.05±1.90），（10.73±1.01）pg/mL]，但二者之間無統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞因子的檢測結(jié)果見圖3。

圖3 黑大蒜組與鮮大蒜組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果

3 討論

大蒜是非常易于人類健康的食品，也是中草藥的一種。除了日常使用之外，國內(nèi)外已將大蒜制成各種各樣的食用品和保健品，如大蒜油膠囊、大蒜復(fù)合飲料、大蒜復(fù)合調(diào)料、天然大蒜防腐劑、脫水大蒜等[8]用于抗病原微生物、抗腫瘤、降血脂、降血糖、提高免疫功能等改善人體健康及其他方面等。近年來日本學(xué)者采用發(fā)酵的辦法將鮮大蒜制成黑大蒜。黑大蒜去除了原有的辣味而略帶有甜味，口感好，無需再經(jīng)處理可直接食用。如此，使得人們拓寬了對大蒜的研究和應(yīng)用范圍。Sasaki等[4]在對黑大蒜提取物和鮮大蒜提取物的成分進(jìn)行分析中發(fā)現(xiàn)，黑大蒜含S-烯丙基-L-半胱氨酸（S-allyl-Lcysteine，SAC）為194.3μg/g，而鮮大蒜為23.7μg/g；前者含γ-谷胺?；?S-烯丙基-L-半胱氨酸（γ-glutamyl-S-allyl-Lcysteine，GSAC）的量為248.7μg/g，而后者為748.7μg/g。黑大蒜的各種氨基酸含量與鮮大蒜也不盡相同，前者的酪氨酸、氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸等的含量顯著高于后者，有的甚至是后者的2倍。為此，本實(shí)驗(yàn)對黑大蒜提取物和鮮大蒜提取物的免疫調(diào)節(jié)劑作用進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示了二者之間存在不同。

NK細(xì)胞不僅具有殺傷病毒感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的作用，而且活化的NK細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞因子增強(qiáng)免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黑大蒜增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的能力要明顯優(yōu)于鮮大蒜。

NO是巨噬細(xì)胞活化后產(chǎn)生的一種效應(yīng)分子，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗菌和抗病毒中發(fā)揮重要的免疫防御作用。Pedraza等[9]曾報道大蒜能促進(jìn)體內(nèi)NO合酶的合成，從而提高NO表達(dá)水平。TNF-α是活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的另一種免疫調(diào)節(jié)因子，可直接抑制殺傷腫瘤細(xì)胞，可促巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌IL-6和IL-8等細(xì)胞因子，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑大蒜誘導(dǎo)NO和TNF-α水平產(chǎn)生明顯強(qiáng)于鮮大蒜，說明前者刺激巨噬細(xì)胞活化的作用強(qiáng)于后者，這可能提示黑大蒜較鮮大蒜有更強(qiáng)的固有細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用。

本實(shí)驗(yàn)室先前的研究已經(jīng)證明，黑大蒜提取物可以誘導(dǎo)以IL-2和IFN-γ為代表的Th1型細(xì)胞因子分泌水平明顯升高，代表Th2型的細(xì)胞因子IL-4未有顯著變化[5]。本實(shí)驗(yàn)對黑大蒜和鮮大蒜提取物的上述細(xì)胞因子的刺激作用進(jìn)行了比較研究之外，還檢測了代表Th17亞群的細(xì)胞因子IL-17的產(chǎn)生水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二種大蒜提取物均可刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ和IL-17的水平增高，在產(chǎn)生的高峰期黑大蒜處理小鼠的該3種細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平顯著高于鮮大蒜處理小鼠，提示黑大蒜較鮮大蒜有更強(qiáng)的Th1/Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答刺激作用。二者對IL-4的產(chǎn)生水平無影響。黑大蒜提取物的此種免疫作用機(jī)制在本實(shí)驗(yàn)室所做的有效治療過敏性哮喘的研究中得到進(jìn)一步證實(shí)。

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