張 喬 金 陽 徐瑞鑫 李廷利

1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院中藥藥理教研室，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150525

四逆散出自于《傷寒論》少陰病篇，為仲景名方。組方柴胡、枳實、芍藥、甘草四味，臨床應用廣泛[1]。近年來有學者針對四逆散做了許多臨床和藥理學研究工作，根據(jù)本實驗室近期的研究來看，四逆散有非常明確的改善睡眠的作用[2]。為進一步闡明基于5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)的四逆散有效組分改善睡眠的作用機制，筆者現(xiàn)通過四逆散有效組分對腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)的多種物質(zhì)含量的影響，表明其相關性。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物

KM種小鼠，清潔級，雄性，體重（23±2）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗室提供。

1.2 實驗藥物

四逆散有效組分的組成成分：辛弗林、芍藥苷、柴胡皂苷C、甘草次酸（均由成都思科華生物技術(shù)有限公司提供），四者比例關系為8∶1∶1∶5，臨用前用含2%吐溫-80的生理鹽水配制成66.00 mg/mL濃度溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 主要實驗試劑

5-羥色氨酸：（Aladdin，批號：30817）；對氯苯丙氨酸：（Sigma，批號：C6506）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 閾下劑量5-HTP聯(lián)合閾下劑量四逆散有效組分對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 取KM種小鼠60只，隨機分成4組，分別為空白組、四逆散有效組分組、5-HTP組以及四逆散有效組分+5-HTP組（即為聯(lián)合組），每組15只，連續(xù)給藥4 d，給藥途徑均為腹腔注射。四逆散有效組分組和聯(lián)合組分別給予四逆散混合有效組分溶液（16.50 mg/mL，165.00 mg/kg，腹腔注射）；空白組和5-HTP組給予等體積生理鹽水，5-HTP組和聯(lián)合組均在注射戊巴比妥鈉前15 min給予5-HTP（2.5 mg/mL，25 mg/kg，腹腔注射），各組末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg，分別記錄各組小鼠入睡的潛伏期及睡眠持續(xù)時間。

2.1.2 四逆散有效組分聯(lián)合PCPA對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 取KM種小鼠60只，隨機分成4組，分別為空白組、四逆散有效組分組、PCPA組以及四逆散有效組分+PCPA組（即為聯(lián)合組），每組15只，連續(xù)給藥4 d，給藥途徑均為腹腔注射。四逆散有效組分組和聯(lián)合組分別給予四逆散混合有效組分溶液（66.00 mg/mL，660.00 mg/kg，腹腔注射）；空白組和PCPA組給予等體積生理鹽水，PCPA組和聯(lián)合組均在注射戊巴比妥鈉前24 h行皮下注射PCPA（30 mg/mL，300 mg/kg，皮下注射），所有各組末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg，分別記錄各組小鼠入睡的潛伏期及睡眠持續(xù)時間。

2.1.3 四逆散有效組分對小鼠前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦等不同腦區(qū)5-HT和5-HIAA含量的影響 取KM種小鼠30只，隨機分成2組，即空白組和四逆散有效組分組，每組15只，四逆散有效組分組分別給予四逆散混合有效組分（66.00 mg/mL，660.00 mg/kg，腹腔注射），空白組注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4 d，末次給藥后30 min，斷頭取腦，低溫分離前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦，分析天平稱重，加入9倍生理鹽水勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）法測定其中5-HT和5-HIAA的濃度。

2.2 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析（Oneway-ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 結(jié)果

2.3.1 閾下劑量四逆散有效組分聯(lián)合5-HTP對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 閾下劑量四逆散有效組分聯(lián)合5-HTP對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響結(jié)果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組以及5-HTP組小鼠無論從睡眠潛伏期均有縮短的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在睡眠持續(xù)時間上均有延長的趨勢，但統(tǒng)計學上無顯著變化（P>0.05）。但是，當閾下劑量四逆散和5-HTP聯(lián)合應用時，與空白組比較，小鼠的睡眠潛伏期明顯縮短（P<0.05），睡眠持續(xù)時間顯著延長（P<0.05）。見表1。

表1 四逆散有效組分聯(lián)合閾下劑量5-羥色氨酸（5-HTP）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

表1 四逆散有效組分聯(lián)合閾下劑量5-羥色氨酸（5-HTP）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05

組別 樣本數(shù) 潛伏期（s）睡眠持續(xù)時間（min）空白組四逆散有效組分組5-HTP組四逆散有效組分+5-HTP 15 15 15 15 228.9±93.7 215.4±68.1 173.0±36.9 130.6±48.2*44.5±20.8 60.2±30.1 50.3±15.0 84.9±20.5*

2.3.2 四逆散有效組分聯(lián)合PCPA對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響 睡眠潛伏期的實驗結(jié)果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組小鼠睡眠的潛伏期明顯縮短（P<0.05）。睡眠持續(xù)時間的實驗結(jié)果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組可以顯著延長小鼠睡眠時間（P<0.05），而PCPA組的睡眠持續(xù)時間明顯縮短（P<0.05）。另聯(lián)合組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 四逆散有效組分聯(lián)合對氯苯丙氨酸（PCPA）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

表2 四逆散有效組分聯(lián)合對氯苯丙氨酸（PCPA）對小鼠睡眠時間的影響（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與四逆散有效組分組比較，#P<0.05

組別 樣本數(shù) 潛伏期（s）睡眠持續(xù)時間（min）空白組四逆散有效組分組PCPA組四逆散有效組分+PCPA 15 15 15 15 293.2±127.6 192.1±48.9*211.7±45.5 272.3±83.9 58.5±12.1 79.3±24.5*37.8±9.8*62.3±18.8#

2.3.3 四逆散有效組分對小鼠不同腦區(qū)5-HT以及5-HIAA含量的影響 實驗結(jié)果表明，與空白組比較，四逆散有效組分組小鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)5-HT的濃度明顯升高（P<0.05），而海馬區(qū)和下丘腦部位的5-HT濃度則無明顯變化（P>0.05）。與空白組比較，，四逆散有效組分組小鼠前額葉皮質(zhì)腦區(qū)的5-HIAA濃度顯著降低（P<0.05），海馬部位和下丘腦區(qū)5-HIAA濃度的雖然都有下降的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3、4。

表3 四逆散有效組分對小鼠不同腦區(qū)5-羥色胺（5-HT）濃度的影響（±s，ng/g）

表3 四逆散有效組分對小鼠不同腦區(qū)5-羥色胺（5-HT）濃度的影響（±s，ng/g）

注：與空白組比較，*P<0.05

組別 樣本數(shù)5-HT前額葉皮質(zhì) 海馬 下丘腦空白組四逆散有效成分組15 15 1 019.1±431.8 1 435.7±458.3*990.5±395.8 1 005.7±289.0 1 198.4±639.0 1 068.2±336.6

表4 四逆散有效組分對小鼠不同腦區(qū)5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）濃度的影響（±s，ng/g）

表4 四逆散有效組分對小鼠不同腦區(qū)5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）濃度的影響（±s，ng/g）

注：與空白組比較，*P<0.05

5-HIAA前額葉皮質(zhì) 海馬 下丘腦空白組四逆散有效組分組15 15 167.26±31.11 140.86±19.87*164.90±23.92 158.15±32.61 166.61±31.13 150.29±36.39

3 討論

中樞5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)作為直接或間接參與睡眠生理調(diào)節(jié)的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，在睡眠和覺醒調(diào)節(jié)方面起重要作用[3]。腦內(nèi)5-HT主要來自中縫核上部，其前體物質(zhì)是色氨酸，經(jīng)色氨酸羥化酶的作用形成5-HTP（5-羥色氨酸），后者在5-羥色胺酸脫羧酶的作用下生成5-HT。因此，破壞5-HT能神經(jīng)末梢或抑制色胺酸羥化酶的作用，會阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，外在表現(xiàn)失眠狀態(tài)。若在此期間注射5-HT的前體物質(zhì)5-HTP（5-羥色氨酸），則失眠可恢復至正常。

本實驗結(jié)果顯示閾下劑量的5-HTP和四逆散有效組分分別應用存在作用趨勢，無顯著性差異，但二者聯(lián)合應用時，產(chǎn)生協(xié)同作用，可明顯延長戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠時間，由此可見，四逆散有效組分對小鼠睡眠的影響與增加腦內(nèi)5-HT前體物質(zhì)5-HTP的含量有關。

PCPA是小鼠腦內(nèi)5-HT合成酶——色氨酸羥化酶的抑制劑，能夠阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，使5-HT濃度降低，是導致小鼠睡眠時間縮短的主要原因[4]。本實驗結(jié)果顯示PCPA明顯縮短戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠持續(xù)時間；當四逆散有效組分聯(lián)合PCPA給藥時，顯示比較四逆散有效組分組睡眠持續(xù)時間明顯縮短（P<0.05），但睡眠持續(xù)時間接近空白組。因此說明PCPA具有明顯拮抗四逆散有效組分延長小鼠睡眠時間的作用，即四逆散有效組分對睡眠的影響同樣和腦內(nèi)5-HT合成酶抑制劑PCPA相關。

5-HIAA是5-HT的代謝產(chǎn)物。腦內(nèi)的5-HT是通過單胺氧化酶使5-HT脫胺生成5-羥吲哚乙醛，再經(jīng)醛脫氫酶催化生成5-HIAA；5-羥吲哚乙醛還可還原生成5-羥色醇，由腎臟排除。二是由突觸膜對5-HT的再攝入作用[5]。本實驗研究表明，四逆散有效組分使5-HT含量增加，5-HIAA含量減少，雖二者上升和下降數(shù)量關系不等，但作用趨勢符合上述的生化代謝[6]。因此，以上研究結(jié)果表明四逆散有效組分對戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的作用與5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)的相關性尤為密切，更進一步機制尚待深入證實。

[1]羅輝昌.四逆散方證實質(zhì)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2005.

[2]李越峰.四逆散改善睡眠作用藥效物質(zhì)基礎研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2009.

[3]Jouvet M.The role of monoamines and acetylcholine-containing neurons in the regulation of the sleep-waking cycle[J].Ergeb Physiol，1972，64：166-307.

[4]Zhao X，Cui XY，Chen BQ，et al.Tetrandrine，a bisbenzylisoquinoline alkaloid from Chinese herb Radix，augmented the hypnotic effect of pentobarbital through serotonergic system[J].Eur J Pharmacol，2004，506（2）：101-105.

[5]周舒，婁艾琳.5-羥色胺的生理和病理生理[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1988：6，103.

[6]劉蓓蓓，張?zhí)N琨.運動與腦組織中5-羥色胺及其代謝物的研究現(xiàn)狀[J].南京體育學院學報：自科版，2005，4（4）：29-33.