遲淑萍 白冰珂 謝 進(jìn) 陳紅鴿 杜 麗 由莉越 程 云

解放軍302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039

腫瘤目前是危害人類健康的主要疾病，環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作為一種抗癌譜廣、療效較好的抗癌藥物，已廣泛應(yīng)用于臨床。由于該藥物的良好抗癌性能，尤其是具有對癌細(xì)胞與正常細(xì)胞殺傷力差別很大這一特性，使得其在臨床得到了廣泛應(yīng)用。環(huán)磷酰胺在細(xì)胞水平以及聯(lián)合用藥等方面的研究較多[1-2]，目前腫瘤化療所應(yīng)用的大多數(shù)藥物，都經(jīng)移植性動物腫瘤試驗(yàn)而被發(fā)現(xiàn)，并以此為模型進(jìn)行疾病發(fā)生機(jī)制和藥物篩選的研究，因此它是篩選抗腫瘤新藥中最常用的模型[3]，對研究腫瘤的病因、發(fā)病機(jī)制、抗癌藥物篩選及腫瘤防治等都具有非常重要的意義[4]?，F(xiàn)階段進(jìn)行的抗癌藥物動物實(shí)驗(yàn)研究過程中，多采用環(huán)磷酰胺作為陽性對照藥物，然而，關(guān)于環(huán)磷酰胺是否具有調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用，尚鮮有人報道。本研究旨在通過建立動物模型（腹水瘤模型和移植性S180肉瘤實(shí)體小鼠模型），觀察腫瘤各相關(guān)基因在環(huán)磷酰胺藥物上的表達(dá)情況以及觀察環(huán)磷酰胺抑制腫瘤的作用，以期進(jìn)一步對環(huán)磷酰胺抑瘤機(jī)制作更深一步探討，為研究抗腫瘤動物模型中陽性對照藥物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)因而發(fā)揮更好的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康昆明系小鼠，清潔級：2級，體質(zhì)量為18～22 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：scxk-（軍）2007-004，飼料符合GB14924-94《實(shí)驗(yàn)動物全價營養(yǎng)飼料》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試藥

環(huán)磷酰胺：山西普德藥業(yè)有限公司（批號20070310）；小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子酶免試劑盒（VEGF Elisa Kit）：上海碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白定量試劑盒：Thermo（批號：JL128100）；液體石蠟油：上海生工生產(chǎn)（生產(chǎn)批號：0110502）；羧甲 基纖維 素鈉溶液（CMC）（貨 號：CDCU-1096553）上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 瘤株

小鼠肉瘤細(xì)胞S180，腹水型，鼠源性H22肝癌細(xì)胞，由302醫(yī)院中藥研究所惠贈。

1.4 儀器

電子天平：梅特勒-托利多常州稱重舍妹系統(tǒng)有限公司制造（型號：SPN202F）；酶聯(lián)儀：北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司制造（型號：ZS-3）。

1.5 方法

1.5.1 建立動物模型 取健康昆明系小鼠10只，雌雄各半，腹腔注射液體石蠟油0.5 mL/只，1周后，分別小鼠腹腔接種S180和H22細(xì)胞，生理鹽水（NS）將其細(xì)胞密度調(diào)整為2×106/mL，腹腔注射0.5 mL/只，1周后，小鼠腹部漲大按之有波動感，繼之將其斷頸處死，取出腹水（無菌條件），調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL（用RPMI1640培養(yǎng)基洗2次后），分別制成細(xì)胞懸液，小鼠右腋皮下接種S180細(xì)胞懸液0.1 mL/只（除外對照組），制成局灶型實(shí)體瘤模型；小鼠腹腔接種H22細(xì)胞懸液0.2 mL/只（除外對照組），建立腹水瘤模型[5]。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 健康昆明系小鼠60只，每組10只，雌雄分盒，排除體重差距大、質(zhì)量不合格動物，適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1 d后，隨機(jī)分為六組，即實(shí)體瘤模型分為三組：對照組、模型組、環(huán)磷酰胺組。對照組給予NS灌胃0.5 mL/只，模型組給予等量1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液灌胃，環(huán)磷酰胺組隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液0.02 g/（kg·d）[6]，0.1 mL/只，連續(xù)給藥15 d。腹水瘤模型分為三組：對照組、模型組、環(huán)磷酰胺組。小鼠末次腹腔接種給藥15 d后，按常規(guī)繼續(xù)飼養(yǎng)，觀察其存活時間，每天量腹圍、稱重，直至模型組小鼠全部死亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 制備腫瘤瘤體 實(shí)體瘤模型小鼠連續(xù)接種瘤細(xì)胞15 d，末次給藥后24 h，測量體重，頸椎脫臼處死，解剖小鼠，剝離瘤體，除去非腫瘤組織包括血污、脂肪、腫瘤新生血管、被膜等，電子天平稱取各組腫瘤組織，計算完整剝離后的瘤體平均重量，與模型組比較，計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=（模型組平均瘤重-環(huán)磷酰胺組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.5.4 計算小鼠肝、脾指數(shù)及生存期延長率 小鼠腹水瘤模型各組接種腹水瘤細(xì)胞24 h后分別每日稱量體重、量取腹圍，按實(shí)驗(yàn)要求給藥并繼續(xù)飼喂，直至小鼠死亡前1 d，計算小鼠體重增重數(shù)（g）和腹圍增長數(shù)（cm）。生存期延長率計算法：以接種腫瘤之日算起至模型組小鼠全部死亡結(jié)束實(shí)驗(yàn)并記錄死亡時間。生存期延長率（%）=環(huán)磷酰胺組平均生存天數(shù)－模型組平均生存天數(shù)/對照組平均生存天數(shù)×100%；脾臟指數(shù)=小鼠脾臟重量（mg）/小鼠體重（g）；肝臟指數(shù)=肝臟重量（100 g）/小鼠體重（g）。

1.5.5 檢測基因表達(dá) Western blot分析：具體步驟詳見《分子克隆》[7]，操作步驟如下：取預(yù)冷的玻璃組織研磨器加入所需瘤體組織和組織裂解液500μL[含苯甲基磺酰氟（PMSF）（2±1）μL]，充分研磨裂解半小時，轉(zhuǎn)入離心管中，反復(fù)振蕩，劇烈渦旋15 s，靜置10 min，4℃下12 000 r/min，離心20 min，收集上清至離心管中靜置10 min（全部冰上操作），離心取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定（BCA法）。取蛋白40μg利用Tris甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），12%分離膠和6%濃縮膠，后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗[血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、P53、P21、凋亡抑制基因（Bcl-2）；1∶1 000]4℃過夜，緩沖液吐溫（tris buffered saline tween，TBST）洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光，采用Alpha Ease FC 4.0軟件進(jìn)行光密度分析，結(jié)果以蛋白相應(yīng)水平與β-actin比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠一般情況

模型組，7 d后生理變化明顯出現(xiàn)異常：精神不振、食欲差、畏寒扎堆、體毛稀疏且干澀、行動遲緩、個別出現(xiàn)肉瘤破潰、腹水形成，環(huán)磷酰胺組較模型組狀況好，但個別亦有少毛、脫毛、精神不振、懶于活動等情況，但無肉瘤破潰及腹水形成。

2.2 環(huán)磷酰胺對小鼠S180肉瘤的影響

荷瘤小鼠建模成功，模型組小鼠在接種后第5天即發(fā)現(xiàn)有出瘤現(xiàn)象，且發(fā)展較快，而環(huán)磷酰胺組出瘤時間延長到第10天，且腫瘤生長緩慢。在剝離小鼠瘤塊時，亦發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺組的小鼠瘤塊體積小，界限分明，質(zhì)地較硬易剝離，而模型組小鼠的瘤塊明顯偏大，有的質(zhì)地軟爛、界限模糊，甚至浸潤到胸骨和鎖骨，不易剝離，與模型組瘤重[（1.31±0.41）g]相比，環(huán)磷酰胺組瘤重[（0.15±0.12）g]顯著減?。≒＜0.01），其抑瘤率達(dá)到88.55%，見圖1。

圖1 環(huán)磷酰胺對小鼠S180肉瘤的抑制情況

2.3 腹水瘤小鼠體重、腹圍、存活期及肝脾指數(shù)的變化

腹水瘤小鼠建模成功，環(huán)磷酰胺組小鼠存活天數(shù)均較模型組長，生命延長率為57.73%，并且環(huán)磷酰胺組腹水相對清亮、色淺，而模型組多為血性腹水，腹圍增長也較模型組小，但小鼠體重增加緩慢，且肝、脾指數(shù)均比模型組指數(shù)小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 環(huán)磷酰胺對小鼠體重、腹圍增長、存活期以及肝、脾臟指數(shù)的影響（±s）

表1 環(huán)磷酰胺對小鼠體重、腹圍增長、存活期以及肝、脾臟指數(shù)的影響（±s）

注：與對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；“-”表示正常小鼠無需計算生命延長率

組別 體重增長（g）腹圍增長（cm）存活天數(shù)（d）生命延長率（%）肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)對照組模型組環(huán)磷酰胺組6.76±1.56 4.85±1.21①3.42±1.67②④0.58±0.09 3.17±0.33②2.30±0.66②④-9.7±2.7 15.3±1.1④-0 57.73 4.04±0.47 4.32±0.14 3.26±0.27①④3.45±0.58 3.84±0.56 2.45±0.34①④

2.4 腫瘤組織中各基因表達(dá)情況

利用荷瘤小鼠實(shí)體瘤子，采用Western blot方法檢測主要腫瘤相關(guān)信號分子VEGF、P53、P21、Bcl-2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2顯示，環(huán)磷酰胺組P53蛋白的相對表達(dá)量明顯高于模型組（con）（P＜0.01）；而P21是該信號通路的經(jīng)典下游分子，但其表達(dá)沒有明顯的變化；Bcl-2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺組可以明顯降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bcl-2分子的表達(dá)量，與模型組相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與腫瘤血管生成密切相關(guān)的VEGF基因是大多數(shù)抗腫瘤藥物的首選靶位點(diǎn)，Western blot檢測結(jié)果顯示：與模型組相比，環(huán)磷酰胺組可以明顯降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF基因的表達(dá)水平（P＜0.01）。見圖2。

表2 四種蛋白含量表達(dá)水平變化

圖2 免疫印跡鑒定分析四種蛋白含量表達(dá)水平的變化

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種常用的細(xì)胞毒抗癌化療藥物，為直接破壞DNA并阻止其復(fù)制的抗癌機(jī)制，對惡性淋巴瘤、急性或慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤有較好的療效，對乳腺癌、睪丸腫瘤、卵巢癌等均具有一定的療效。其藥理作用及藥代動力學(xué)指標(biāo)均有了較為明確的研究，成為目前抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)研究中廣泛應(yīng)用的對照藥品。因此，為更好地發(fā)揮其在腫瘤動物實(shí)驗(yàn)中作為陽性藥物的選擇性優(yōu)勢，急待進(jìn)一步研究環(huán)酰胺的抗腫瘤作用及其抑瘤機(jī)制。而當(dāng)今抗腫瘤藥物主要通過激活或者抑制一系列的腫瘤相關(guān)信號通路而發(fā)揮治療腫瘤的作用。經(jīng)典的腫瘤相關(guān)信號通路涉及腫瘤抑癌基因P53，P21信號通路；抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2信號通路；血管生長因子VEGF信號通路等。本研究對環(huán)磷酰胺的抑瘤作用分別對上述信號通路進(jìn)行相關(guān)檢測。

P53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高最經(jīng)典的抑癌基因[8]，研究表明，在人類50%的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)P53基因有缺失或突變[9]，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)磷酰胺作用腫瘤細(xì)胞后，能促使P53蛋白明顯表達(dá)，同時，筆者進(jìn)行了P53下游分子P21的檢測，與對照組相比，P21蛋白表達(dá)量卻沒有變化，由此推測環(huán)磷酰胺通過激活P53分子發(fā)揮其抑瘤作用，而不是通過P53→P21這條經(jīng)典的信號通路實(shí)現(xiàn)的，這與文獻(xiàn)報道相一致[10]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子是目前活性最強(qiáng)、專屬性最高的血管生成因子，在腫瘤血管生成中處于核心地位[10]。血管生成過程中的關(guān)鍵因子是VEGF及其受體，它與腫瘤生長侵襲及轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)聯(lián)，血管生成更易引起實(shí)體瘤的增生和轉(zhuǎn)移，幾乎所有的腫瘤都能產(chǎn)生VEGF，并且在腫瘤患者的血清及瘤體內(nèi)均能檢測到異常增高的VEGF[11]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，環(huán)磷酰胺組明顯下調(diào)瘤體中VEGF蛋白表達(dá)水平，因此初步認(rèn)為，抑制腫瘤的增生可能是環(huán)磷酰胺通過降低VEFG的活性而達(dá)到抑瘤效果的。根據(jù)功能的不同，Bcl-2基因家族可以分為兩大類：一類是Bcl-2為代表的抗細(xì)胞凋亡基因，另一類是bax促細(xì)胞凋亡基因。通常情況下，兩種蛋白表達(dá)量在細(xì)胞內(nèi)處于相對穩(wěn)態(tài)，而穩(wěn)態(tài)一旦被打破，信號分子Bcl-2的活性更高，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖，Bcl-2的異常表達(dá)已經(jīng)在一系列腫瘤組織的研究中得到證實(shí)[12]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，環(huán)磷酰胺Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，由此推測可能是通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平而起到抑瘤的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究、探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺對小鼠S180肉瘤的抑瘤作用穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)，其抑瘤率均可穩(wěn)定達(dá)到70%以上，并可通過促進(jìn)抑癌基因P53的表達(dá)，抑制VEGF的生成，降低抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)等多種途徑，發(fā)揮抑制腫瘤的作用，研究發(fā)現(xiàn)該腫瘤相關(guān)分子機(jī)制，將為環(huán)磷酰胺作為抗腫瘤陽性藥物動物模型奠定重要的理論基礎(chǔ)。

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