王群茹 蔣明德 吳曉玲 黃 麗 胡曉松 劉 靜

1.成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，四川成都 610083；2.四川省綿陽市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川綿陽 621000；3.成都醫(yī)學院形態(tài)學教研室，四川成都 610083；4.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科，四川成都 610500

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于炎癥性腸病的一種，是一種由多因素導致的腸道慢性炎癥性疾病，其病因和發(fā)病的分子機制尚未完全闡明，故目前對于該病藥物保守治療尚存在分歧，且缺乏有效的預防復發(fā)的措施，被世界衛(wèi)生組織（WHO）確認為現(xiàn)代難治性疾病之一。Toll樣受體在基因水平上調(diào)控著眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，而TLR4-NF-κB介導的信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，本實驗采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導UC模型，觀察Toll樣受體4（TLR4）及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達，探討UC可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雌性Balb/c小鼠20只，6～7周齡，體重16～22 g，購自四川實驗動物研究所，合格證號SCDY（川）2010-06，稱重編號后查隨機數(shù)字表分為兩組：生理鹽水對照組（N組）、潰瘍性結(jié)腸炎模型組（M組），每組各10只，清潔級實驗室飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

DSS：美國Sigma公司；兔抗鼠（人）NF-κB p65多克隆抗體，購于美國Abcom公司；兔抗鼠（人）TLR4多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PV-9001兔超敏二步法免疫組化檢測試劑、PV-9003山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒，均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。將葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶于三蒸水中，配成5%DSS溶液。

1.3 方法

1.3.1 UC動物模型的制備 M組：Balb/c小鼠自由飲用5%DSS溶液7 d，復制小鼠UC模型[1-2]，造模之日起，每天觀察小鼠大便性狀和便血情況（聯(lián)苯胺法檢測大便隱血），活動、體重等，模型建立成功的判定標準根據(jù)半稀便、腹瀉、大便隱血（+）和肉眼血便等癥狀和形態(tài)學改變確定。N組：自由飲用生理鹽水7 d。造模7 d后取與M組同水平段的結(jié)腸組織。1.3.2結(jié)腸組織形態(tài)學檢測 肉眼觀察結(jié)腸組織黏膜及漿膜面的變化。取新鮮結(jié)腸組織一塊，修整后大小約1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，置于包埋盒于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，5μm厚切片，HE染色光鏡觀察組織形態(tài)學變化并由兩位病理醫(yī)師進行雙盲法評分[3]。

1.3.3 TLR4、NF-κB活性測定 采用免疫組織化學方法檢測NF-κB p65、TLR4的原位表達水平。一抗工作濃均為1∶50，按照SP法免疫組化說明書嚴格操作。顯微鏡觀察染色情況：細胞質(zhì)或細胞核染為棕黃色為陽性細胞。采用Axioplan 2 imaging顯微圖象分析系統(tǒng)對每張切片任意取五個高倍視野，測定陽性細胞表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，指標間的相關性分析采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般狀況

給藥后第3天有4只小鼠出現(xiàn)黃綠色和黃色稀便，體重下降，毛發(fā)無光澤、飲水和進食下降等，其中4只大便隱血陽性，第4天3只小鼠出現(xiàn)肉眼血便，且有肛門血染，之后體重明顯下降、毛發(fā)松散脫落、懶動、精神萎靡。癥狀逐漸加重，觀察時均至少有3只小鼠肛門帶血，證明造模成功。N組小鼠大便、體重、毛發(fā)、飲食、活動等一般狀況均正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2.2 兩組病理改變及評分[3]

N組：小鼠結(jié)腸黏膜完整，光滑，腺體層次清楚、清晰可見，未見糜爛、潰瘍及中性粒細胞浸潤等。M組：結(jié)腸黏膜缺如，可見大小及深淺各異的多發(fā)性潰瘍；出現(xiàn)黏膜脫落，腺體結(jié)構(gòu)不清，排列不規(guī)則，腺跑腔消失，伴有大量炎細胞浸潤，以中性粒細胞為主，炎癥部位主要位于黏膜和黏膜肌層，少數(shù)侵及漿膜層；黏膜下水腫明顯，淋巴濾泡存在；在病變相對較輕的組織，潰瘍與部分完整腺體并存。M組小鼠結(jié)腸遠端損傷較近端嚴重（圖1）。與N組相比，M組形態(tài)學評分顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 N組與M組結(jié)腸組織HE染色（HE，×400）

表1 各組小鼠形態(tài)學評分（±s，分）

表1 各組小鼠形態(tài)學評分（±s，分）

注：與N組相比，*P＜0.05

組別 只數(shù) 組織學評分N組M組10 10 0.62±0.13 3.53±0.52*

2.3 兩組免疫組化染色結(jié)果

N組NF-κB為弱陽性表達，與N組相比，M組小鼠于結(jié)腸組織黏膜上皮及黏膜下呈強陽性表達，主要表達于細胞質(zhì)和細胞核，以細胞核為著，且結(jié)腸炎癥黏膜區(qū)NF-κB表達遠高于非炎癥黏膜區(qū)。與N組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

N組小鼠TLR4偶見表達，且不均一。M組小鼠主要表達于結(jié)腸上皮，黏膜下及炎癥細胞中，呈顆粒狀表達于胞漿。M組小鼠結(jié)腸上皮和炎癥細胞中的表達高于N組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表2、圖2）。且M組小鼠在結(jié)腸的表達呈現(xiàn)炎癥區(qū)遠高于非炎癥區(qū)，表達部位與炎癥細胞聚集的部位相一致，表達越強，炎癥越重，且TLR4的表達與NF-κB p65的表達呈正相關（Pearson相關系數(shù)r為0.816）。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB、TLR4表達光密度值（OD值）比較（±s）

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB、TLR4表達光密度值（OD值）比較（±s）

注：與N組相比，r=0.816，*P＜0.05

組別 只數(shù) NF-κB TLR4 N組M組10 10 0.224±0.062 0.724±0.124*0.232±0.047 0.684±0.073*

圖2 兩組免疫組化染色（SP，×400）

3 討論

Toll樣受體屬于Ⅰ型跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)13個TLRs成員。TLRs與其相應配體識別、結(jié)合，繼而激活相應的信號傳導通路，從而對不同的外界刺激產(chǎn)生特定的生物學功能。多項研究證實TLRs是腸道免疫反應的一類關鍵介質(zhì)，在機體發(fā)揮的免疫反應中發(fā)揮著重要作用，對于維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)也起著重要作用[4]。TLR4是第一個被發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體，其介導的信號通路被激活后可非特異性的與相應的病原相關分子模式（PAMPs）結(jié)合，活化該條信號轉(zhuǎn)導通路，然后NF-κB激活，繼而激發(fā)相關促炎因子的轉(zhuǎn)錄，炎癥因子大量產(chǎn)生釋放，引發(fā)炎癥[5]。相關研究發(fā)現(xiàn)在UC患者中，NF-κB表達明顯增高[6-7]，炎性因子釋放增多，提示TLR4參與UC發(fā)病，且發(fā)揮重要作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)M組小鼠TLR4、NF-κB在黏膜下層及固有層的表達較N組顯著增強，且表達水平與形態(tài)學評分一致，提示TLR4、NF-κB表達越廣泛、越強，病變越重，這與國內(nèi)外的報道相符[8-10]。其可能機制為小鼠腸道內(nèi)出現(xiàn)革蘭陽性、陰性細菌等危險信號刺激時，TLR4、NF-κB信號通路激活，導致結(jié)腸組織內(nèi)經(jīng)由TLRs/NF-κB信號通路激活各種炎癥介質(zhì)的釋放，如白介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、黏附分子和干擾素（interferon，IFN）等，從而引發(fā)結(jié)腸組織過強的免疫反應，從而損傷結(jié)腸黏膜組織。李鵑等[11]研究發(fā)現(xiàn)采用TLR4單克隆抗體可下調(diào)小鼠結(jié)腸黏膜干擾素等炎癥因子mRNA的表達而發(fā)揮干預作用。同時TLR4、NF-κB在N組小鼠結(jié)腸組織及炎性細胞低表達，這可能與腸道形成免疫耐受有關。正常腸道黏膜對TLRs配體如脂多糖處于持續(xù)刺激耐受狀態(tài)，對外界刺激反應較低，保持著亞激活狀態(tài)[12-17]，可能與結(jié)腸組織為了維持腸道黏膜平衡狀態(tài)，在必要時產(chǎn)生適當?shù)拿庖叻磻?，即與結(jié)腸組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等有關。除此外也有報道[18]在UC的發(fā)生中TLR4的高表達可能與細菌入侵腸黏膜上皮后導致免疫失衡有關。

本實驗揭示TLR4和NF-κB在潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中的高表達提示該信號傳導通路激活且導致下游炎癥因子的釋放可能是UC發(fā)生、發(fā)展的機制之一，但其具體分子靶點尚有待于進一步深入研究。

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