何 斌 孫曉青

1)徐州醫(yī)學院腫瘤生物治療實驗室 徐州 221002 2)徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科 徐州 221002

Gli－1基因的RNAi對前列腺癌DU145細胞的影響

何 斌1)孫曉青2)

1)徐州醫(yī)學院腫瘤生物治療實驗室 徐州 221002 2)徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科 徐州 221002

目的 研究膠質瘤相關癌基因1(Gli－1)對前列腺癌DU145細胞的生物學影響。方法 通過脂質體介導的方法將Gli－1 SiRNA轉染前列腺癌DU145細胞，RT－PCR檢測Gli－1 mRNA變化，Western Blot法檢測其蛋白的表達，CCK－8法檢測轉染后細胞增殖，運用Transwell小室法檢測細胞侵襲能力的變化。結果 轉染Gli－1SiRNA的細胞Gli－1的表達明顯低于陰性對照組(NC)與空白組(P﹤0.05)，Gli－1SiRNA抑制細胞增殖并降低細胞的侵襲能力。結論 Gli－1 SiRNA可抑制前列腺癌DU145細胞中Gli－1的表達，降低細胞增殖率和侵襲能力，提示Gli－1可能在前列腺癌的惡性進展中起著重要作用。

前列腺癌;Gli－1;SiRNA;侵襲

前列腺癌是生殖系最常見的惡性腫瘤之一，晚期易進展為非激素依賴性前列腺癌。近年來發(fā)現(xiàn)Hh(Hedgehog)－Gli信號通路在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中其關鍵作用，而Gli－1作為該通路下游轉錄激活子在腫瘤研究中受到廣泛關注［1］，DU145為雄激素非依賴性細胞，侵襲力強且高表達Gli－1［2］，鑒于此本研究構建針對Gli－1基因的小分子干擾RNA(small interfering RNA，SiRNA)序列，轉染入DU145細胞，觀察SiRNA對DU145細胞增殖和侵襲能力的影響，有望為非雄激素依賴性前列腺癌治療提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料根據(jù)Genbank報道的homo Gli－1(Gene ID 2735)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成Gli－1SiRNA雙鏈，序列見表1。人前列腺癌 DU145細胞株購自中科院上海細胞研究所，Ham’s F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Fatal bovine serum，F(xiàn)BS)為Hyclone公司產品，LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產品，RNA提取試劑盒購自北京TIANGEN公司，RT－PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由上海生工合成，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購自碧云天公司，Gli－1多克隆抗體為武漢博士德公司產品，CCK－8購自日本株式會社同仁化學研究所，Matrigel基質膠為BD公司產品，纖維粘連蛋白(fibibronectin，F(xiàn)N)為Sigma公司產品，Transwell小室為Corning公司產品。

表1 Gli－1 SiRNA序列

1.2 DU－145細胞的培養(yǎng)及轉染DU－145細胞用含10%FBS的Ham’sF12的培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取生長良好且處于對數(shù)生長期的細胞以2.5×105個/孔的密度接種于6孔板，待細胞融合達50%，參照吉瑪公司SiRNA使用指南配制脂質體與SiRNA復合物轉染DU145細胞。實驗分為3組:(1)未轉染SiRNA的空白組。(2)轉染NC SiRNA的陰性對照組⑶轉染Gli－1 SiRNA的實驗組。

1.3 RT－PCR檢測RNAi后Gli－1 mRNA變化DU145轉染后48 h，加入Trizol 1mL按照其說明書總提RNA，將RNA濃度調至0.5μg/μL。取 RNA 4μL逆轉錄合成 cDNA，用 dNTP(10 mmol/L)1μL，Mgcl2(25 mmol/L)4μL，10×B μffer 5 μL，上下游引物(10 μM)2 μL，DNA聚合酶0.3μL，cDNA 5μL，無核酶水32.7μL的反應體系進行PCR。Gli－1上游引物:GGACAACCGCCATCCAGACT，下游引物:GCCAGGGACACCTCCATCTC，產物長度363bp;β－actin上游引物GTTGCTATCCAGGCTGTGC，下游引物GCATCCTGTCGGCAATGC，產物長度248 bp。擴展條件如下:95℃預變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，再72℃延伸5 min。將RT－PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)字成像系統(tǒng)拍照分析。

1.4 Western Blot法檢測RNAi后Gli－1蛋白的表達取轉染48 h后各組細胞，收集細胞提取蛋白，取BCA法蛋白定量后每個泳道加50 μL蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜(NC)上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗室溫孵育2 h，NBT/BCIP顯色。蛋白條帶以β－actin為參照，測定數(shù)據(jù)以各組條帶的吸光度/對照組條帶吸光度表示，篩選最優(yōu)干擾組。

1.5 CCK－8檢測RNAi后DU145細胞增殖情況將DU145以胰酶消化計數(shù)后接種于96孔板上，每孔約1000個細胞，進行轉染并分為3組:空白組，NC組與Gli－1 SiRNA最優(yōu)干擾組。置入培養(yǎng)箱中24 h，每隔24 h在各組待測孔中加入10μL CCK－8，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在酶標儀上以波長450 nm檢測待測孔光密度值，每組每次6復孔，計算平均值與標準差，連測3 d，繪制細胞生長曲線，重復3次。

1.6 細胞侵襲實驗檢測RNAi后侵襲能力Transwell小室上室加入50μL稀釋的Matrigel基質膠，下室加入的10μg/mL的FN 50μL，超凈臺風干過夜。用前以無血清培養(yǎng)基水化基底膜置入37℃培養(yǎng)箱孵育1 h。取轉染24 h各組細胞，無血清培養(yǎng)基制備成2×105/mL的細胞懸液，取200 μL細胞懸液，接種至Transwell上室鋪勻，在下室內加入含10%FBS的培養(yǎng)基600 μL，每組設3個復孔，常規(guī)培養(yǎng)36 h。取出Transwell小室，棉簽擦去上室細胞，95%甲醇固定30min，結晶紫染色30min，PBS沖洗，鏡下隨機選取4個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Gli－1 SiRNA下調DU145細胞中Gli－1的Mrna結果顯示，實驗組Gli－1 mRNA表達均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，mRNA表達量(%)分別為陰性對照組98.2±6.6，SiRNA－1為63.3±3.2，SiRNA－2為53.8±4.6，SiRNA－3為38.4±4.0，以SiRNA－3沉默效果最佳。見圖1

2.2 Gli－1 SiRNA抑制DU145細胞中Gli－1的蛋白表達結果顯示，實驗組Gli－1蛋白表達均低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，蛋白表達量(%)分別為陰性對照組94.9±7.9，SiRNA－1組55.7±5.6，SiRNA－2組42.6±3.2，SiRNA－3組31.9±5.1，SiRNA－3確為最佳干擾組。見圖2

2.3 Gli－1 SiRNA抑制DU145細胞的增殖結果顯示，實驗組增殖低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，72 h相對增值率(%)分別為陰性對照組(97.1±1.8)%，SiRNA－3組39.6±2.6。見圖3

2.4 Gli－1 SiRNA減弱DU145細胞的侵襲力在沉默Gli－1基因表達后，DU145細胞在Transwell小室內的穿膜細胞數(shù)(個)分別為空白對照組269±15，陰性對照組263±21，SiRNA－3組165±24，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明SiRNA－3可降低細胞侵襲能力。見圖4

3 討論

Hh－Gli信號通路的異常激活在人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其中包括前列腺癌［3］，通路在調控前列腺發(fā)育與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展與激素抵抗等方面發(fā)揮的重要作用已被多數(shù)研究證實［2，4－5］，2005年美國國家癌癥研究所將該通路列為前列腺癌靶向治療的靶標，雄激素受體排次要地位［6］。該信號通路由Hh基因，跨膜受體smo與ptch，轉錄因子Gli家族(Gli－1、Gli－2、Gli－3)與下游目的基因構成，Hh基因編碼一系列糖蛋白，當沒有Hh信號分子時，Smo被Ptch所抑制，阻礙信號轉導;當Hh信號分子存在時，Ptch與Hh蛋白結合，解除了對Smo的抑制，Smo活化后向胞內傳遞信號給Gli，Gli進入細胞核以后激活目的基因轉錄［7］。Gli家族作為該通路最后一環(huán)，各成員的功能并不完全相同，多數(shù)情況下Gli－2與Gli－1功能一致，為Hh－Gli通路下游轉錄激活子，而Gli－3則起抑制作用［1］。

Gli－1作為Hh－Gli通路下游被廣泛承認的轉錄激活因子，并可作為Shh－Gli通路活化的標記，這一點已為大眾認知［8］。Gli－1通過以下機制誘導腫瘤產生:上調細胞周期調節(jié)分子Cyclin D2表達量促進細胞有絲分裂，不斷增殖［9］;激活抗凋亡因子bcl－2轉錄活性來抑制凋亡;激活VEGF、Cyclin D等提高細胞侵襲轉移能力，且參與腫瘤細胞增殖或擴散的效應分子(如BMP、Cyclin D等)已被證實為Hh－Gli通路的下游分子［10］。Sanchez等使用RT－PCR對腫瘤標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)標本中Gli－1高度表達［11］。Karhadkar等發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細胞系(PC－3、DU－145、LnCAP及CWR22RV1)均有Gli－1高表達，增加Gli的異位表達則可促使低轉移前列腺癌細胞向高轉移性癌細胞轉化［2］。目前針對Hh信號通路的環(huán)靶明等藥物只能針對Hh通路上游基因突變導致的腫瘤有效，在Smo級聯(lián)反應以下的一些參與Hh通路調控的分子變化則沒有意義且毒性較大限制了在臨床上的應用。作為Hh通路的最終效應蛋白，針對Gli直接對Hh通路下游目的基因的激活進行阻斷，可以更好的抑制前列腺癌細胞的增殖、分化及侵襲。

在本實驗中，通過使用Gli－1 SiRNA阻斷Hh－Gli－1通路，發(fā)現(xiàn)可以明顯減少前列腺癌 DU145細胞中Gli－1基因mRNA及其蛋白的表達，明顯抑制該細胞生長、侵襲能力，表明了Gli－1 SiRNA可以特異性抑制內源基因表達，抑制DU145細胞增殖和體外侵襲能力，為前列腺癌的基因治療提供了新的思路。

［1］Buttitta L，Mo R，Hui CC，et al.Interplays of Gli2 and Gli3 and their requirement in mediating Shh－dependent sclerotome induction［J］.Development，2003，130:6 233－6 243.

［2］Karhadkar SS，Bova GS，Abdallah N，et al.Hedgehog signalling in prostate regeneration，neoplasia and metastasis［J］.Nature，2004，431:707－712.

［3］ Vassiliki Tzelepi，Maria Karlou，Sijin，et al.Expression of hedgehog pathway compo－nents in prostate carcinoma microenvironment:shifting the balance towards autocrine signaling［J］.Histopathology，2011，58(7):1 037－1 047.

［4］Zhu G，Zhua HE，He H，et al.Sonic and desert hedgehog signaling in human fetal prostate development［J］.Prostate，2007，67(6):674－684.

［5］Shaw G，Price AM，Ktori E，et al.Hedgehog signaling in androgen independent prostate cancer［J］.Eur Urol，2008，54 (6):1 333－1 343.

［6］Vanchieri C.Scientists hopeful as they uncover molecular clues to prostate cancer［J］.JNCI，2005，97:168－169.

［7］Kayed H，Kleeff J，Osman T，Keleg S，Buchler MW，F(xiàn)riess H.Hedgehog signaling in the normal and diseased pancreas［J］.Pancreas，2006，32(2):119－129.

［8］Mao J，Maye P，Kogerman P，et al.Regulation of Gli1 transcriptional activity in the nucleus by Dyrk1［J］.Biol Chem，2002，277(38):35 156－35 161.

［9］Duman－Scheel M，Weng L，Xin S，Du W.Hedgehog regulates cell growth and pro－liferation by inducing Cyclin D and Cy－cline［J］.Nature，2002，417(6886):299－304.

［10］Keping Xie，James L Abbruzzese.Developmental biology informs cancers［J］.Cancer Cell，2003，4(4):245－247.

［11］ Sanchez P，Hernandez AM，Stecca B，et al.Inhibition of prostate cancer proliferation by interference with sonic hedgehog－gli1 signaling［J］.Proc Natl Acad Sci，2004，101 (34):12 561－12 566.

R737.25

A

1007－8991(2012)05－0018－04

(收稿 2012－03－27)