劉 英 周 林 謝曉敏 楊 澤 (寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 75000)

2型糖尿病(T2DM)是一種多基因遺傳、多因素綜合作用而導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，不同種族基因型多態(tài)性頻率的差異形成了種族特異的遺傳結(jié)構(gòu)，每一個(gè)特定的變異在不同研究人群的作用也不盡相同，因此，對(duì)不同種族人群中的易感基因進(jìn)行驗(yàn)證有著重要意義。研究顯示，褪黑素受體1B基因(MTNR1B基因)，是在歐洲人中發(fā)現(xiàn)的作用效果僅次于基因轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)的T2DM易感基因〔1〕。研究表明，人體內(nèi)脂質(zhì)譜的異常可能是糖尿病患病的危險(xiǎn)因素。本研究主要探討MTNR1B rs138715基因多態(tài)性與寧夏漢族T2DM患者及其體內(nèi)脂質(zhì)譜的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 遵循知情自愿的原則，選取534例寧夏漢族個(gè)體作為研究對(duì)象，其中病例組(T2DM組)為2007年2月至2009年1月寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院及門診T2DM患者295例(男154例，女141例);對(duì)照組(NGT組)為性別、年齡、民族、地域匹配的健康體檢者239例(男119例，女120例)。T2DM患者均符合1999年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)〔2〕診斷標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖 ＜6.1 mmol/L，餐后 2 h血糖 ＜7.8 mmol/L，排除嚴(yán)重肝、腎疾病及自身免疫性疾病，研究對(duì)象間無(wú)親緣關(guān)系，且雙親連續(xù)三代均為同一民族，均無(wú)糖尿病、高血壓、高脂血癥家族病史。T2DM組人群民族、年齡、性別、身高、體重與NGT組人群比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)指標(biāo) 測(cè)量身高及體重，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)，并測(cè)量血壓、腰圍、臀圍，計(jì)算腰臀比。取空腹靜脈血5 ml，檢測(cè)甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FPG)，最后測(cè)餐后2 h血糖(2 h PG)。

1.2.2 基因提取及多態(tài)性分析 取靜脈血400 μl，采用TIAN-amp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用RFLP-PCR檢測(cè)基因多態(tài)性。PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，上游引物:5'CCAAGGACACCCAGTTAGTGAG 3'，下游引物:5'CCACCTTTATGCAGAACACCTTAT 3'。PCR 反應(yīng)體系 10 μl，其中包括模板 DNA 2 μl、上下游引物各 0.1 μl、dNTP 0.2 μl、10 × PCR 緩中液 1 μl、Tag DNA 聚合酶 0.2 μl、雙蒸水 7.5 μl。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃ 7 min，變性 94℃30 s，退火 57℃ 50 s，延伸 72℃ 60 s，總延伸 72℃10 min，共 35個(gè)循環(huán)。選用限制性內(nèi)切酶MVaⅠ(60℃ 3 h～4 h)酶切PCR產(chǎn)物，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，溴化乙錠(EB)染色，Gel DOC-2000成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn))顯像以分析確定MTNR1B基因rs138715的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，計(jì)量資料用s表示，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和病例組臨床特點(diǎn)比較 兩組之間BMI(P=0.044)、腰圍(P=0.001)和 TG(P=0.000)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 基因型鑒定 MTNR1B rs1387153位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段大小為545 bp，經(jīng)MVaⅠ限制性內(nèi)切酶消化后出現(xiàn)3種基因型:野生型CC(344 bp+53 bp+77 bp+36 bp+35 bp)、雜合型TC(397 bp+344 bp+53 bp+77 bp+36 bp+35 bp)和變異型TT(397 bp+77 bp+36 bp+35 bp)。見(jiàn)圖 1(因 53 bp、77 bp、36 bp、35 bp片段小，故在電泳圖上沒(méi)有顯示)。

2.3 對(duì)照組和病例組基因多態(tài)性分布比較 MTNR1B rs1387153位點(diǎn)基因型在三組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，基因型頻率和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 NGT組、T2DM組臨床特點(diǎn)比較(s)

表1 NGT組、T2DM組臨床特點(diǎn)比較(s)

指標(biāo) NGT組 T2DM組 F值 P值90.16±9.72 95.71±8.37 6.816 0.001 BMI(m2/kg)26.34±3.77 27.65±4.06 3.174 0.044 DBP(mmHg)119.94±17.96 122.85±23.5 0.418 0.659 SBP(mmHg)72.63±12.38 75.59±13.63 1.010 0.366 TC(mmol/L)4.90±1.21 5.26±1.41 1.333 0.266 TG(mmol/L)1.77±0.88 2.87±1.77 14.020 0.000 HDL-C(mmol/L)1.02±0.20 1.05±0.24 0.699 0.498 LDL-C(mmol/L)腰圍(cm)3.11±0.94 2.89±1.095 0.953 0.387

2.4 MTNR1B rs1387153基因多態(tài)性與各變量的關(guān)系 三種基因型之間除TG水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)外，其他各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.5 多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析顯示，T2DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是TG和腰圍。見(jiàn)表4。

圖1 MINB1B rs1387153 C/T位點(diǎn)PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

表3 各基因型的不同變量的比較(s)

表3 各基因型的不同變量的比較(s)

指標(biāo) CC CT TT F值 P值BMI(m2/kg)26.76±4.67 26.72±3.72 27.60±3.85 1.166 0.314腰圍(cm)92.30±10.30 91.47±9.32 93.59±9.36 1.073 0.344 TG(mmol/L)1.79±0.93 2.05±1.30 2.41±1.45 3.134 0.046 DBP(mmHg)119.41±16.96 120.20±18.93 123.21±21.75 0.668 0.514 SBP(mmHg)72.43±11.43 73.00±13.32 75.56±12.63 1.110 0.331 FPG(mmol/L)6.35±2.66 6.68±2.97 7.08±3.17 0.783 0.459 TC(mmol/L)4.89±1.35 5.05±1.08 5.09±1.34 0.290 0.748 HDL-C(mmol/L)1.01±0.21 1.04±0.21 1.02±0.21 0.307 0.736 LDL-C(mmol/L)3.07±1.02 3.08±1.02 2.98±0.95 0.207 0.813

表4 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

MTNR1B基因位于染色體11q21-q22區(qū)域，由兩個(gè)外顯子組成，其mRNA總長(zhǎng)為1 662 bp，MTNR1B基因編碼的 MT2是兩個(gè)已知的人類褪黑激素受體之一〔3〕。MTNR1B基因rs1387153位于MTNR1B基因的5'端28.3 kb處，MTNR1B基因編碼的產(chǎn)物MT2是G蛋白耦聯(lián)受體之一，它和另外一個(gè)G蛋白耦聯(lián)受體MT1共同介導(dǎo)褪黑素的作用。褪黑素是由松果體分泌的主要激素，褪黑素的分泌具有明顯的晝夜節(jié)律性。對(duì)人類和嚙齒動(dòng)物的研究表明，晝夜節(jié)律的破壞可能引起包括糖尿病在內(nèi)的代謝性疾病〔4～6〕。鑒于T2DM個(gè)體中MTNR1B基因的表達(dá)量增加，推測(cè)其致病機(jī)制可能直接通過(guò)抑制β細(xì)胞的作用而介導(dǎo)T2DM的發(fā)生〔7〕，從而導(dǎo)致MTNR1B基因的變異與FPG含量的升高和T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，MTNR1B基因是T2DM的易感基因。

Bouatia-Naji〔8〕等對(duì)法國(guó)人的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn) MTNR1B基因附近的單核酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1387153中T等位基因與FPG含量升高和患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于rs1387153位點(diǎn)中T等位基因與T2DM關(guān)聯(lián)研究的報(bào)道還比較少，本研究推測(cè)rs1387153中T等位基因可能在寧夏地區(qū)漢族人群中的暴露比例較低，因而對(duì)T2DM發(fā)病的作用效果相對(duì)較弱，如果要得到更加確切的結(jié)論，需要增大樣本量進(jìn)行研究。另外，CC、CT和TT三種基因型的TG水平比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)，TT組的TG水平明顯高于其他兩組。說(shuō)明寧夏漢族T等位基因與高水平的TG有關(guān)?；貧w分析顯示，T2DM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素依次是TG和腰圍。腰圍是中心型肥胖的指標(biāo)，提示中心型肥胖是寧夏漢族T2DM發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

總之，本研究并未識(shí)別到MTNR1B基因多態(tài)性與寧夏漢族T2DM發(fā)病之間具有相關(guān)性，但與TG水平相關(guān)。

1 Spars T，Grarup N，Andreasen C，et al.Combined analysis of 19 common validated type 2 diabetes susceptibility gene variants shows moderate discriminative value and no evidence of gene-gene interaction〔J〕.Diabetologia，2009;52(7):1308-14.

2 美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì).糖尿病診療標(biāo)準(zhǔn)(一)——美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)2005年公布〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2005;25(6):436-7.

3 Prokopenko I，Langenberg C，F(xiàn)lorez JC，et al.Variants in MTNR1B influence fasting glucose levels〔J〕.Nat Genet，2009;41(1):77-81.

4 Peschke E，Stumpf I，Bazwinsky I，et al.Melatonin and type 2 diabetes-a possible link〔J〕?J Pineal Res，2007;42(4):350-8.

5 Xiang AH，Wang C，Peters DK，et al.Coordinate changes in plasma glucose and pancreatic beta-cell function in Latino women at high risk for type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2006;55(4):1074-9.

6 Pandi-Perumal SR，Trakht I，Srinivasall V，et al.Physiological effects of melatonin:role of melatonin receptors and signal transduction pathways〔J〕.Prog Neurobiol，2008;85(3):335-53.

7 Lyssenko V，Nagorny CL，Erdos MR，et al.Common variant in MTNR1B associated with increased risk of type 2 diabetes and impaired early insulin secretion〔J〕.Nat Genet，2009;41(1):82-8.

8 Bouatia-Naji N，Bonnefond A，Cavalcanti-Proenca C，et al.A variant near MTNR1B is associated with increased fasting plasma glucose levels and type 2 diabetes risk〔J〕.Nat Genet，2009;41(1):89-94.