王劍，馬宏躍，丁安偉，張軍峰，詹瑧，唐于平

(1．南京中醫(yī)藥大學藥學院江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京 210046;2．南京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210046)

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizan Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostietus Schneider)耳后腺及皮脂腺分泌的白色漿液干燥物［1］?，F(xiàn)代研究表明，中藥蟾酥單用或經適當配伍具有強心、抗炎、抗感染和抗腫瘤等作用［2－3］。蟾酥中的蟾蜍甾烯類化合物是蟾酥發(fā)揮抗腫瘤以及鎮(zhèn)痛功效的主要藥效活性物質［4－5］，尤其是日蟾毒它靈(gamabufotalin)、沙蟾毒精(arenobufagin)、遠華蟾毒精(telocinobufagin)、蟾毒它靈(bufotalin)、蟾毒靈(bufalin)、華蟾毒靈(cinobufagin)、去乙酰蟾毒它靈(desacety－bufotalin)、嚏根草苷元(hellebrigenin)、脂蟾毒配基(resibufogenin)、羥基華蟾毒配基(cinobufotalin)等甾烯類化合物成分［6－7］。本研究以Hela細胞株為研究對象，考察蟾蜍甾烯類化合物(Bul、Btl、Arg、Hel、Tel、Deb、Ctl、Gtl、Cbg、Rbg)對其生長抑制作用，比較10種成分對Hela細胞的毒性差異，并結合各化合物化學結構，探討其構效關系。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器

PowerWave X 340型酶標儀(美國BIO－TEKINSTRUMENTS，INS．公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司);實驗室級超純水器(南京易普易達科技發(fā)展有限公司);超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)。

1．1．2 試藥和試劑

日蟾毒它靈(gamabufotalin，Gtl);沙蟾毒精(arenobufagin，Arg);遠華蟾毒精 (telocinobufagin，Tel);蟾毒它靈(bufotalin，Btl);蟾毒靈(bufalin，Bul);華蟾毒靈(cinobufagin，Cbgl);去乙酰蟾毒它靈(desacety－bufotalin，Deb);嚏根草苷元(hellebrigenin，Hel);脂蟾毒配基(resibufogenin，Rbg);華蟾毒它靈(cinobufotalin，Ctl)均由本實驗室自制，經波譜鑒定，純度均大于95%。陽性對照藥:拉帕替尼。

RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司);二甲亞砜(DMSO，國藥集團化學試劑有限公司);噻唑藍(MTT，美國Amresco公司，0793);青霉素鈉、硫酸鏈霉素、胰蛋白酶(美國Amresco公司)。

1．1．3 細胞株及細胞培養(yǎng)

細胞株:宮頸癌Hela細胞株(北京協(xié)和藥物研究所細胞庫提供)。

1．2 方法

1．2．1 樣品制備 精密稱取10種蟾酥甾烯類化合物(Gtl、Arg、Tel、Btl、Bul、Cbg、Deb、Hel、Rbg、Ctl)以及陽性對照藥拉帕替尼適量，溶于二甲亞砜(DMSO)中配制。用含0．1%DMSO的RPMI 1640將10個樣品按等比分別稀釋成 10－5、10－6、10－7、10－8g/ml(μg/ml)四個濃度，使樣品中溶媒DMSO的濃度均為0.1%;同樣方法配制拉帕替尼。

1．2．2 改良MTT法測樣品對人腫瘤細胞的細胞毒活性

取對數(shù)生長期細胞，密度調整為4×104個/ml，100μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。加樣組每孔分別加入100μl不同濃度的樣品(10－5～10－8g/ml)，陰性對照為等體積的含0.1%DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)液，陽性對照為等體積的10－5～10－8g/ml(μg/ml)四個濃度的拉帕替尼。加樣組及對照組均設6個復孔，每塊板均設有12個空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育72h后，加入10μl/孔的MTT(5mg/ml)。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出上清液，加入150μl DMSO溶液，渦旋振蕩，用酶標儀在570nm、620nm雙波長下測定各孔的OD值。以各復孔的平均值作為該組細胞的OD值，并按下列公式計算細胞生長抑制率。實驗重復3遍，結果取其平均值，并計算IC50。

抑制率(%)=［1－(加藥組平均OD570nm值－加藥組平均OD620nm值)/(對照組平均OD570nm值－對照組平均OD620nm值)］×100%

1．2．3 10種蟾酥甾烯類化合物化學結構式

Pubchem數(shù)據(jù)庫采集蟾蜍甾烯Bu的10種分子化學結構，具體見圖1。

圖1 10種蟾酥甾烯類化合物化學結構式

2 結果

2．1 10種蟾蜍甾烯(Bu)類化合物對Hela細胞的增殖抑制作用

如表1所示，10種Bu抑制Hela細胞增殖的效果不同，其活性順序為Bul＞Btl＞Arg＞Hel＞Tel＞Deb＞Ctl＞Cbg＞Gtl＞Rbg。

2．2 10種蟾酥甾烯類化合物構效關系分析

蟾酥甾烯類化合物為強心甾體類化合物，基本母核由24個碳原子組成。母核部分的C－17位上連有一個不飽和內酯環(huán)α－吡喃酮(α－pyrone)基，為β－構型，在母核的其它位置出現(xiàn)羰基、羥基、環(huán)氧基等取代基。蟾毒配基類化合物的化學結構見圖2、圖3和表2。

圖2 蟾蜍內酯類化合物A－B的結構母核

表1 10種蟾蜍甾烯類化合物對Hela細胞的IC50μg/ml(n=6)

表2 蟾蜍甾烯類化合物

圖3 蟾蜍甾烯類化合物構效關系分類樹狀圖

圖3所示，先根據(jù)甾體母核將10種化合物分為A、B型兩大類，并分別求出各類的 IC50平均值，IC50A=1.646μg/ml，IC50B=0.292μg/ml，B 型結構化合物(Gtl、Arg、Tel、Btl、Bul、Deb、Hel)細胞毒性較強一些，A型化合物(Ctl、Cbg、Rbg)抗腫瘤活性比較弱。

從羥基數(shù)目來分類，A型結構母核中，比較IC50數(shù)值(2.329μg/ml與0.28μg/ml)，顯示羥基數(shù)目多的化合物對Hela細胞毒性強一些;而在B型母核中，IC50數(shù)值(0.008μg/ml與0.405μg/ml)顯示的是羥基數(shù)目少的化合物對Hela細胞毒性強。

以羥基取代位置來分類，同型結構母核以及相同羥基數(shù)目的化合物，比較IC50數(shù)值，顯示化合物在母核上的羥基取代位置不同，對Hela細胞毒性也完全不同，如圖中的 Gtl、Arg、Deb、Tel、Hel，對 Hela 細胞毒性強到弱，羥基取代位置依次在母核部分的C－5位、C－16位、C－11位上。

在兩類母核中，數(shù)值IC50=0.448μg/ml(Cbg)與IC50=4.210μg/ml(Rbg)、IC50=0.0002μg/ml(Btl)與IC50=0.016μg/ml(Bul)，顯示含有乙?；幕衔飳ela細胞毒性強。

3 討論

蟾蜍甾烯類化合物的抗腫瘤活性存在差異［8－10］，這可能與其化學結構不同有一定的關系［11－13］。本研究以宮頸癌細胞株Hela作為細胞模型，研究比較了蟾蜍甾烯類 10種化合物(Gtl、Arg、Tel、Btl、Bul、Cbg、Deb、Hel、Rbg、Ctl)細胞毒性作用。結果表明，10種化合物均能有效抑制細胞生長，且抑制作用隨濃度的增高而增強。通過比較發(fā)現(xiàn)，其細胞增殖抑制作用強度依次是Bul＞Btl＞Arg＞Hel＞Tel＞Deb＞Ctl＞Cbg＞Gtl＞Rbg，由此結果結合化學結構進行構效關系分析。

首先將上述化合物分成兩種母核類型。然后在同類母核中，進一步以羥基數(shù)目、乙?；鶖?shù)目、羥基在母核上的取代位置為標準將兩類化合物進行分類，計算其IC50平均值，以此表示不同化學結構下的細胞毒性大小。結果表明，B型結構的蟾蜍甾烯類化合物整體活性優(yōu)于A型母核，說明14－OH成為氧環(huán)后，活性明顯下降。在A、B母核中，羥基的數(shù)量對活性的影響趨勢不同。在相同母核中，對僅含一個羥基的化合物，存在乙?；够衔飳ela的細胞毒性增強?？梢?，蟾蜍甾烯類化合物化學結構中的母核部分、取代基羥基數(shù)目、羥基取代位置以及乙酰化與否，均與化合物對Hela細胞毒性有相關性。

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