牟少亮，劉志欽，賴 燕，蔡漢陽，何水林

(福建農(nóng)林大學(xué):a.生命科學(xué)學(xué)院，b.作物遺傳改良與綜合利用教育部重點(diǎn)實驗室，c.作物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

在自然生態(tài)環(huán)境中植物遭受各種病害的危害，并在長期進(jìn)化過程中形成復(fù)雜的抗病機(jī)制，包括PTI(PAMP triggered immunity)和ETI(effector triggered immunity)2種彼此相互關(guān)聯(lián)的抗病反應(yīng)［1-2］。其中ETI是由抗性基因R(resistance gene)介導(dǎo)的?；钥共》磻?yīng)，與PTI相比，其強(qiáng)度大而持久。目前已經(jīng)克隆獲得多種植物的R基因并對其抗病功能進(jìn)行了分析，結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明:這些R基因可分成NBSLRR、eLRR-TM、eLRR-TM-pkinase、STK(serinethreonine kinase)和其他5大類型［3］。它們的作用符合“基因?qū)颉睂W(xué)說，在植物抗病基因工程中具有重要的應(yīng)用價值，但迄今為止對這些抗病基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的研究報道還很少［4］。

水稻(Oryza sativa L.)是重要的糧食作物之一，白葉枯病〔Xanthomonas campestris pv.oryzae(Ishiyama)Dye〕是水稻生產(chǎn)上僅次于稻瘟病〔Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr.〕的主要病害，不僅可導(dǎo)致水稻大幅度減產(chǎn)，而且還影響稻米品質(zhì)［5］。由于其危害嚴(yán)重，化學(xué)防治難以奏效，因此，培育抗病品種是有效防治水稻白葉枯病的重要手段之一［6］。目前，已報道的水稻白葉枯病抗性基因有30多個［7］，其中，Xa21基因是最早克隆的水稻白葉枯病廣譜抗性基因，屬于STKLRR類抗性基因，定位于水稻第11號染色體。Xa21基因編碼的蛋白可以通過胞外LRR(leucine-rich repeat)域識別病原物的無毒基因編碼產(chǎn)物，然后將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)活化STK的表達(dá)，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的防御反應(yīng)［7-8］。研究表明:Xa21基因可下調(diào)其信號通路上游調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因，激活PR(pathogenesisrelated)基因表達(dá)［9］;Xa21基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)受發(fā)育時期的調(diào)控，植株在2葉期感病、5葉期有75%抗病、9葉期之后完全抗?。?0］。雖然關(guān)于Xa21基因的表達(dá)已有報道［10-11］，但這些研究結(jié)果存在爭議。

為了進(jìn)一步闡明水稻Xa21基因的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，作者以水稻品種‘日本晴’(‘Nipponbare’)為實驗材料，對Xa21基因5'端的上游啟動子進(jìn)行克隆及序列分析，并獲得了其與GUS(β-葡萄糖苷酸酶)報告基因的轉(zhuǎn)基因水稻T1代株系，通過分析轉(zhuǎn)基因水稻中GUS基因表達(dá)的組織和器官特異性及其對不同逆境和逆境相關(guān)激素信號分子的應(yīng)答情況，確定水稻Xa21基因5'端上游啟動子的表達(dá)特性，以期為抗白葉枯病水稻品種的育種研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用水稻品種‘日本晴’、大腸桿菌〔Escherichia coli(Migula)Castellani et Chalmers〕菌株DH10B和根癌農(nóng)桿菌〔Agrobacterium tumefaciens(Smith et Towns.)Conn.〕菌株EHA105均為本實驗室保存的實驗材料;pMD18-T質(zhì)粒和DL2000均購自寶生物工程(大連)有限公司;pDNOR-207和pMDC163質(zhì)粒由瑞士蘇黎世大學(xué)Curtis教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 啟動子克隆和測序 參照GenBank上公布的水稻品種‘日本晴’基因組DNA序列進(jìn)行上、下游引物的設(shè)計，其中，上游引物Xa21-F序列為5'-AGA GTTGCTGCCCCTTGAT-3'，下游引物Xa21-R序列為5'-GTGCAAGCTAAGACAGCAAGA-3'。

參照文獻(xiàn)［12］采用CTAB法提取基因組總DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在Tgradient型PCR儀(德國Biometra公司)上進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為 50 μL，包括0.2 μg 模板 DNA、10×PCR buffer 5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物各2 μL和5 U·μL-1Ex Taq DNA聚合酶0.4 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸2 min，共計35個循環(huán);最后于72℃延伸10 min。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將獲得的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，以DL2000為Marker;采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收，并將回收產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，交送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Gateway技術(shù)［13］，分別以 pDNOR-207和 pMDC163為入門載體和目的載體，構(gòu)建Xa21基因啟動子的GUS融合表達(dá)載體。PCR驗證采用Xa21基因啟動子的特異擴(kuò)增引物，驗證正確后轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得 以水稻品種‘日本晴’的成熟胚為受體材料，參照Toki等［14］的方法進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化。從獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株中提取DNA，利用潮霉素基因特異引物HypF和HypR進(jìn)行PCR驗證，其中，上游引物HypF序列為5'-ACACAGCCATCGGTCCAGAC-3'，下游引物HypR序列為5'-ATCTTAGCCAGACGAGCGGG-3'。

1.2.4 GUS檢測與定量分析 根據(jù)潮霉素基因特異引物對轉(zhuǎn)基因水稻的PCR驗證結(jié)果，收集陽性植株的T1代種子;選擇T1代種子分離比接近3∶1的株系進(jìn)行Xa21基因啟動子驅(qū)動的GUS活性的組織染色和定量分析。參照J(rèn)efferson［15］的方法，對T1代轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖和葉分別進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，GUS染色液包含0.2 mol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)、0.1 mol·L-1鐵氰化鉀、0.1 mol·L-1亞鐵氰化鉀、1.0 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%X-Gluc。取T1代轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖和葉，并在不同發(fā)育時期(水稻3葉期、5葉期和8至9葉期)采集葉片，參照曾凡鎖等［16］的分光光度法測定GUS活性，以1 min內(nèi)使PNPG(4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)水解生成1 nmol·L-1對硝基苯酚的酶量為1個酶活力單位。

1.2.5 對轉(zhuǎn)基因植株的處理方法 收獲的T1代轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)潮霉素抗性篩選后進(jìn)行培養(yǎng)，7～8 d后將正常萌發(fā)的綠色幼苗移栽至裝有土壤的塑料花盆中，待幼苗長到4至5葉期時分別進(jìn)行各種處理，對照組植株不進(jìn)行任何處理，然后取樣按照上述方法進(jìn)行GUS定量分析。機(jī)械損傷處理方法:用解剖刀在幼苗葉片上切割數(shù)處2～3 cm傷口，12 h后取葉片進(jìn)行GUS活性測定。干旱處理方法:停止?jié)菜?8 h后待幼苗葉片出現(xiàn)微蔫狀態(tài)時取葉片進(jìn)行GUS活性測定。激素處理方法:分別用500 μmol·L-1水楊酸(SA)、100 μmol·L-1脫落酸(ABA)和100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)進(jìn)行葉面噴灑，每株10 mL，12 h后取葉片進(jìn)行GUS活性測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 10.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和處理;GUS活性為10個單株的平均值。

2 結(jié)果和分析

2.1 水稻Xa21基因啟動子的克隆和序列分析

以水稻品種‘日本晴’為實驗材料，通過PCR擴(kuò)增得到1條長1 982 bp的片段(圖1)，將該片段的測序結(jié)果(圖2)與GenBank上報道的水稻品種‘日本晴’的序列進(jìn)行比對，顯示二者的序列同源性百分率為99.7%。將獲得的此片段序列登錄至啟動子順式元件預(yù)測網(wǎng)站 (http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行分析［17］，結(jié)果表明:除了啟動子的基本元件(TATA-box和CAAT-box)外，在該片段上還預(yù)測到一些逆境信號相關(guān)元件，如:GCC-box(乙烯應(yīng)答元件)、A-box(順式調(diào)控元件)、TC-rich repeats(逆境應(yīng)答元件)、MBS(MYB結(jié)合位點(diǎn))、LTR(低溫應(yīng)答元件)和W-box(病原菌應(yīng)答元件)，表明擴(kuò)增獲得的水稻Xa21基因啟動子可能在外界逆境脅迫時具有誘導(dǎo)能力。

圖1 水稻品種‘日本晴’Xa21基因啟動子的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of Xa21 gene promoter of cultivar‘Nipponbare’of Oryza sativa L.

2.2 在轉(zhuǎn)基因水稻中Xa21基因啟動子的表達(dá)特征

圖2 水稻品種‘日本晴’Xa21基因啟動子序列及其相關(guān)元件Fig.2 Sequence of Xa21 gene promoter of cultivar‘Nipponbare’of Oryza sativa L.and its related elements

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因水稻不同器官GUS活性的組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 Histochemical staining result of GUS activity in different organs of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)

2.2.1 在不同器官中的表達(dá)特征 GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果表明(圖3):在T1代轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖和葉中都能檢測到GUS活性，特別是在根尖的中柱組織中GUS活性明顯高于其他組織(圖3-D)，具有一定的組織表達(dá)特異性。而GUS活性定量檢測結(jié)果顯示(表1):轉(zhuǎn)基因水稻幼苗根的GUS活性是葉片的2.31倍，且二者間的差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);莖的GUS活性是葉片的1.93倍，二者間的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05);根的GUS活性略高于莖，但二者間的差異不顯著(P＞0.05)。

表1 T1代轉(zhuǎn)基因水稻不同器官中GUS活性比較(±SD)1)Table 1 Comparison of GUS activity in different organs of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)(±SD)1)

表1 T1代轉(zhuǎn)基因水稻不同器官中GUS活性比較(±SD)1)Table 1 Comparison of GUS activity in different organs of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)(±SD)1)

1)同列中不同的小寫和大寫字母分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

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2.2.2 在不同發(fā)育時期的表達(dá)特征 T1代轉(zhuǎn)基因水稻3葉期、5葉期和8至9葉期葉片的GUS活性見表2。由表2可見:由Xa21基因啟動子驅(qū)動的GUS活性受到水稻發(fā)育時期的影響;在8至9葉期葉片的GUS活性極顯著高于3葉期(P＜0.01)，是3葉期的2.68倍;8至9葉期葉片的GUS活性也顯著高于5葉期(P＜0.05)，是5葉期的 2.00倍;而5葉期葉片的GUS活性略高于3葉期，但差異不顯著(P＞0.05)。表明隨轉(zhuǎn)基因水稻苗齡的增長，Xa21基因啟動子驅(qū)動的GUS活性逐漸增加。

表2 不同發(fā)育期T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)1)Table 2 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)at different developmental stages(±SD)1)

表2 不同發(fā)育期T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)1)Table 2 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)at different developmental stages(±SD)1)

1)同列中不同的小寫和大寫字母分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著Different small letters and capitals in the same column indicate the significant difference at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

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2.2.3 在不同逆境及激素處理條件下的表達(dá)特征通過GUS活性定量分析，在干旱、機(jī)械損傷以及不同激素處理條件下T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片中GUS的活性見表3。由表3可見:機(jī)械損傷12 h后，轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的GUS活性顯著高于對照(P＜0.05)，為對照的1.24倍;干旱處理48 h后，轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的GUS活性變化并不明顯;用100 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理12 h后，轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的GUS活性極顯著高于對照(P＜0.01)，為對照的 1.39倍;經(jīng) 500 μmol·L-1水楊酸和100 μmol·L-1脫落酸處理 12 h后，轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的GUS活性與對照差異不顯著。

表3 在不同處理條件下T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)Table 3 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)under different treatments(±SD)

表3 在不同處理條件下T1代轉(zhuǎn)基因水稻葉片中GUS活性比較(±SD)Table 3 Comparison of GUS activity in leaf of T1 strain of transgenic rice(Oryza sativa L.)under different treatments(±SD)

1)＊＊:對照與處理組間差異極顯著(P＜0.01)The extremely significant difference between the control and treatment group(P＜0.01);*:對照與處理組間差異顯著(P＜0.05)The significant difference between the control and treatment group(P＜0.05).

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3 討論和結(jié)論

研究結(jié)果表明:從水稻品種‘日本晴’中擴(kuò)增得到1條長度為1 982 bp的片段，該片段與GeneBank中登錄的水稻品種‘日本晴’Xa21基因啟動子序列的同源性高達(dá)99.7%，據(jù)此推斷該序列為Xa21基因啟動子。通過順式作用元件預(yù)測該序列包含有GCC-box、A-box、TC-rich repeats、MBS、LTR 和 W-box 等逆境信號相關(guān)元件。GUS活性分析結(jié)果顯示:該啟動子在水稻的根、莖和葉中均能表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量最高，特別是在根尖的中柱組織中集中表達(dá);在不同發(fā)育時期以及在不同的逆境和外源激素處理條件下，該啟動子均能表達(dá)，但表達(dá)量有明顯差異，其中，8至9葉期表達(dá)量最高，機(jī)械損傷以及100 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理均能促進(jìn)該啟動子的表達(dá)。

基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與其功能之間相互適應(yīng)，這是生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種重要的適應(yīng)機(jī)制。Century等［10］的研究結(jié)果表明:水稻不同發(fā)育時期Xa21基因的表達(dá)變化不顯著，而且轉(zhuǎn)基因植株對白葉枯病和創(chuàng)傷處理不敏感，說明Xa21基因很可能是在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控;而Park等［11］的研究結(jié)果則表明:白葉枯病可以誘導(dǎo)水稻Xa21基因的表達(dá)，在幼苗期和成苗期過量表達(dá)Xa21基因都可以增加水稻的抗病性。造成上述研究結(jié)果不一致的原因可能是不同研究者采用的PCR反應(yīng)引物不同所致。由于水稻基因組中抗病基因家族很大，不同成員之間存在著序列同源性，研究人員在設(shè)計引物時模板區(qū)域的選擇有一定差異，因此難以獲得基因家族特定成員特異性表達(dá)的數(shù)據(jù)。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，啟動子的活性在很大程度上可以反映基因的表達(dá)情況，因此通過分析基因啟動子的表達(dá)特征推測基因的表達(dá)，可以彌補(bǔ)上述研究的不足之處。根據(jù)本研究結(jié)果，推測水稻Xa21基因的表達(dá)明顯受水稻發(fā)育時期的影響，隨著水稻苗齡的增長，Xa21基因的表達(dá)水平逐漸升高，說明在水稻不同發(fā)育期的抗性差異與Xa21的表達(dá)密切關(guān)聯(lián)。

水稻白葉枯病是一種細(xì)菌性病害，自然條件下從寄主的傷口或自然開放的孔口(如水孔)侵入，進(jìn)入木質(zhì)部后繁殖并轉(zhuǎn)移到植株的全身，其危害主要發(fā)生在葉片及葉鞘部位［5］。Chen 等［18］的研究結(jié)果表明:在水稻根系中，Xa21基因也能對白葉枯病病原菌產(chǎn)生抗性。本研究結(jié)果表明:Xa21基因啟動子驅(qū)動的GUS活性在水稻根尖的中柱區(qū)域表達(dá)量明顯較高，這與Xa21介導(dǎo)的白葉枯病抗性特征相吻合［18］。茉莉酸(JA)是植物體內(nèi)重要的內(nèi)源性信號分子，茉莉酸信號途徑參與了水稻對白葉枯病的抗病反應(yīng)［19-20］。在本研究中，外源茉莉酸甲酯可以顯著增強(qiáng)水稻中Xa21基因啟動子驅(qū)動的GUS活性，也說明Xa21介導(dǎo)的白葉枯病抗性依賴于茉莉酸信號通路。

［1］JOENS J D G，DANGL J L.The plant immune system［J］.Nature，2006，444:323-329.

［2］趙開軍，李巖強(qiáng)，王春連，等.植物天然免疫性研究進(jìn)展及其對作物抗病育種的可能影響［J］.作物學(xué)報，2011，37(6):935-942.

［3］王友紅，張鵬飛，陳建群.植物抗病基因及其作用機(jī)理［J］.植物學(xué)通報，2005，22(1):92-99.

［4］MOHR T J，MAMMARELLA N D，HOFF T，et al.The Arabidopsis downy mildew resistance gene RPP8 is induced by pathogens and salicylic acid and is regulated by W-box cis elements［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2010，23(10):1303-1315.

［5］王運(yùn)豐.水稻白葉枯病的綜合防治措施［J］.農(nóng)村實用科技信息，2011(8):38.

［6］毛凌華，聶元元，李 瑤，等.水稻白葉枯病抗性基因及其分子標(biāo)記輔助選擇育種研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23(8):115-117.

［7］鄂志國，王 磊.水稻抗病性基因的克隆和功能研究進(jìn)展［J］.遺傳，2009，31(10):999-1005.

［8］SONG W Y，WANG G L，CHEN L L，et al.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene，Xa21［J］.Science，1995，270:1804-1806.

［9］GAN Q，BAI H，ZHAO X F，et al.Transcriptional characteristics of Xa21-mediated defense responses in rice［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2011，53(4):300-311.

［10］CENTURY K S，LAGMAN R A，ADKISSON M，et al.Developmental control of Xa21-mediated disease resistance in rice［J］.The Plant Cell，1999，20(2):231-236.

［11］PARK C J，LEE S W，CHERN M，et al.Ectopic expression of rice Xa21 overcomesdevelopmentally controlled resistanceto Xanthomonas oryzae pv.oryzae［J］.Plant Science，2010，179(5):466-471.

［12］張 睿，陶建敏，蔡斌華，等.藤稔葡萄花發(fā)育相關(guān)基因啟動子的克隆及功能分析［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報，2011，20(4):17-23.

［13］CURTIS M D，GROSSNIKLAUS U.A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta［J］.Plant Physiology，2003，133(2):462-469.

［14］TOKI S，HARA N，ONO K，et al.Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice［J］.The Plant Journal，2006，47(6):969-976.

［15］JEFFERSON R A.Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fusion system［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1987，5(1):387-405.

［16］曾凡鎖，錢晶晶，康 君，等.轉(zhuǎn)基因白樺中GUS基因表達(dá)的定量分析［J］.植物學(xué)報，2009，44(4):484-490.

［17］LESCOT M，DéHAIS P，THIJS G，et al.PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences［J］.Nucleic Acids Research，2002，30(1):325-327.

［18］CHEN F，GAO X J，MIAO Y S，et al.Plasma membrane localization and potential endocytosis of constitutively expressed Xa21 proteins in transgenic rice［J］.Molecular Plant，2010，3(5):917-926.

［19］MAHMOOD T，JAN A，KAKISHIMA M，et al.Proteomic analysis of bacterial-blight defense-responsive proteins in rice leaf blades［J］.Proteomics，2006，6(22):6053-6065.

［20］SHEN X L，YUAN B，LIU H B，et al.Opposite functions of a rice mitogen-activated protein kinase during the process of resistance against Xanthomonas oryzae［J］.The Plant Journal，2010，64(1):86-99.