張 林，徐迎春，成海鐘，周玉珍，婁曉鳴，呂文濤

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇南京210095;2.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，江蘇蘇州215008)

朱頂紅(Hippeastrum spp.)原產(chǎn)于中南美洲，為石蒜科(Amaryllidaceae)朱頂紅屬(Hippeastrum Herb.)所有種類的總稱，其花大色艷、葉形優(yōu)美，具有較高的觀賞價值。目前，國內(nèi)朱頂紅產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，但在生產(chǎn)實踐中應用的品種主要引自荷蘭，且自主培育的新品種還處于起步階段。朱頂紅雜交品種較原種有觀賞價值高、環(huán)境適應性強等優(yōu)點，但在長期選育過程中原種已丟失，加之對引進品種的遺傳背景并不了解，無法確定大部分栽培品種的親緣關(guān)系［1］。經(jīng)過長期的人工栽培選育，朱頂紅存在較大的遺傳分化，遺傳多樣性高，采用傳統(tǒng)的分類方法很難區(qū)分其種下類群及品種［2］。

ISSR標記引物為隨機引物，無需預先知道基因組序列，具有成本低、條帶清晰且重復性好的特點。目前，ISSR 標記已用于鳶尾(Iris tectorum Maxim.)［3］、茶〔Camellia sinensis(L.)O.Ktze.〕［4］、桂花〔Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.〕［5］、紅麻(Hibiscus cannabinus L.)［6］、桑樹(Morus alba L.)［7］和菊花〔Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.〕［8］等植物的遺傳多樣性研究以及通過構(gòu)建ISSR指紋圖譜進行品種鑒定。劉本英等［4］利用4條ISSR引物組合對40份云南大葉種茶樹種質(zhì)資源進行了鑒別;李梅等［5］利用引物ISSR12和ISSR27鑒別了84份桂花種源。目前，Chakrabarty等［9］采用RAPD標記確定出部分雜交朱頂紅品種的親緣關(guān)系，但有關(guān)朱頂紅ISSR標記鑒定的相關(guān)研究尚未見報道。

作者以2個來自蘇州本地的朱頂紅品種和60個引自荷蘭的朱頂紅品種為研究對象，利用ISSR分子標記技術(shù)進行遺傳多樣性分析，以期揭示朱頂紅不同品種間的親緣關(guān)系、構(gòu)建62個朱頂紅品種的ISSR指紋圖譜，為朱頂紅雜交親本的選擇以及新品種鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的62個朱頂紅品種均采集于蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院園藝中心，其中60個品種引自荷蘭，分別為‘蘋果花’(‘Apple Blossom’)、‘橙色塞維’(‘Orange Sovereign’)、‘維拉’(‘Vera’)、‘簡女士’(‘Lady Jane’)、‘瑪 麗’(‘MaryLou’)、‘卡 里 美 柔 ’(‘Calimero’)、‘紅孔雀’(‘Red Peacock’)、‘哈庫’(‘Hercules’)、‘蒙特布朗’(‘Mont Blanc’)、‘紅獅’(‘Red Lion’)、‘雙跡’(‘Double Record’)、‘薩德’(‘Pasadena’)、‘安 迪’(‘Andes’)、‘女 神 ’(‘Aphrodite’)、‘當 娜’(‘Donau’)、‘帆 船 ’(‘Benfica’)、‘所羅門’(‘Solomon’)、‘粉色精華’(‘Pink Blossom’)、‘精靈’(‘Elvas’)、‘花孔雀’(‘Blossom Peacock’)、‘舞 蹈 皇 后’(‘Dancing Queen’)、‘鳳 蝶’(‘Papilio’)、‘極 品’(‘Best Seller’)、‘雅典娜’(‘Athene’)、‘貝貝星’(‘Baby Star’)、‘波 利 舞 曲’(‘Bolero’)、‘卡 門 ’(‘Carmen’)、‘丁 克’(‘Celica’)、‘誘 惑 ’(‘Charisma’)、‘圣誕禮物’(‘Charismas Gift’)、‘小丑’(‘Clown’)、‘希望’(‘Desire’)、‘俏皮玫瑰’(‘Donau Rose’)、‘小精靈’(‘Fairytale’)、‘游戲’(‘Faro’)、‘白孔雀’(‘White Peacock’)、‘園藝師’(‘Floris Hekkere’)、‘希望’(‘Green Goddes’)、‘自由’(‘Liberty Donker’)、‘耀眼的路德維格’(‘Ludwig Dazzler’)、‘曼波樂曲’(‘Mambo’)、‘奧拉夫’(‘Olaf’)、‘奧林帕斯’(‘Olympus’)、‘帕梅拉’(‘Pamela’)、‘花邊香石竹’(‘Picotee’)、‘紅里花邊香石 竹’(‘PicoteeRedLining’)、‘雞 尾 酒’(‘Piquant’)、‘序 曲’(‘Prelude’)、‘約 翰 遜 ’(‘President Johnson’)、‘承諾’(‘Promise’)、‘快車’(‘Rapido’)、‘羅馬’(‘Roma’)、‘桑河’(‘San Remo’)、‘明 星’(‘Showmaster’)、‘蘇 珊 ’(‘Susan’)、‘珍 品’(‘Unique’)、‘火 焰 孔 雀’(‘Flaming Peacock’)、‘小紅星’(‘Xiaohongxing’)、‘阿 爾 卑 斯 之 角’(‘Matterhorn’)和‘月 光’(‘Moonlight’);另有2個品種為蘇州本地品種。每個品種采集1個單株的嫩葉，置于硅膠中干燥，帶回實驗室于4℃冰箱中保存、備用。

參考加拿大哥倫比亞大學(UBC)的引物設(shè)計ISSR引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成;Taq DNA聚合酶、dNTPs和10×PCR buffer等購于寶生物工程(大連)有限公司，Marker購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;AG22331型梯度PCR擴增儀為Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

采用CTAB法［10］提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(日本島津公司)檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至20 ng·μL-1。ISSR-PCR擴增體系總體積20 μL，其中包含 Taq DNA 聚合酶1.0 U、模板 DNA 40 ng、10×PCR buffer 2 μL，其他成分終濃度分別為 Mg2+1.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物 0.50 μmol·L-1。擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃ 變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，38個循環(huán);最后于72℃延伸8 min。反應產(chǎn)物置于4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg·L-1溴化乙錠)進行電泳檢測，電泳緩沖液為 0.5×TBE，電泳時電壓為5 V·cm-1;電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)儀(上海天能科技有限公司)上觀測、分析并拍照。

以形態(tài)特征差異大的朱頂紅品種的基因組DNA為模板，利用上述擴增體系和程序從100條ISSR引物中篩選適宜引物及各引物適宜的退火溫度。引物篩選條件:連續(xù)2次梯度PCR后條帶清晰且不彌散、條帶重復出現(xiàn)、具有較高多態(tài)性。適宜退火溫度則選擇適宜溫度范圍內(nèi)偏高的溫度。篩選出的引物及退火溫度用于所有供試樣品的PCR擴增反應。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與分析

根據(jù)電泳結(jié)果，記錄清晰可重復的DNA電泳條帶;對于同一引物的擴增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為1個位點，同一位點上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。只記錄易于辨認的條帶，排除模糊不清的條帶;遷移率相同但強度不同的條帶均記為“1”［11］。采集的數(shù)據(jù)輸入Excel 2010工作表，建立表征數(shù)據(jù)矩陣;運用NTSYS-PC(2.10e版)軟件計算62個品種間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，并進行UPGMA聚類分析。

由于針對所有朱頂紅品種的基因組DNA用同一引物擴增出的條帶有差異，因此可以利用條帶差異進行品種鑒定。首先，針對所有供試品種，對11個引物的擴增條帶進行一一比對，選出鑒別能力強的引物;然后對由鑒別能力強的引物擴增出的電泳條帶進行形象化處理，同一位點上記為“1”的條帶用黑方塊表示、記為“0”的條帶用白方塊表示，由此構(gòu)建62個朱頂紅品種的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果和分析

2.1 ISSR－PCR擴增結(jié)果分析

從100個ISSR引物中篩選出多態(tài)性高、重復性好的11條引物(表1)，分別以62個朱頂紅品種的基因組DNA為模板，在300～3 000 bp內(nèi)共擴增出118條帶，平均每個引物擴增出10.7條帶。其中，多態(tài)性條帶109條，多態(tài)性條帶百分率高達92.4%;引物UBC834、UBC836、UBC840、UBC850 和 UBC857 的多態(tài)性條帶百分率達到100.0%;多態(tài)性條帶百分率最低的為引物UBC862，僅76.9%。由此可見，供試的62個朱頂紅品種具有較豐富的遺傳多樣性。

在11條引物中，8條引物為二核苷酸重復序列，2條引物為三核苷酸重復序列，1條引物為四核苷酸重復序列，表明朱頂紅基因組中以二核苷酸重復序列居多，其中5條是堿基A-G或G-A重復引物。在朱頂紅基因組DNA復制過程中，由于與A-G或G-A重復序列結(jié)合的靶序列可能存在滑動和不均等交換現(xiàn)象，從而較易引起引物結(jié)合位點和兩結(jié)合位點之間片段長度的差異［12］。

2.2 基于遺傳相似系數(shù)的62個朱頂紅品種的聚類結(jié)果分析

以62個朱頂紅品種的118條譜帶數(shù)據(jù)建立原始矩陣，獲得兩兩品種間的遺傳相似系數(shù)1 891個;其中，2個蘇州本地品種間的遺傳相似系數(shù)最大，達到0.842 9;品種‘安迪’與‘桑河’間的遺傳相似系數(shù)最小，僅0.371 4?；? 891個遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法構(gòu)建了供試62個朱頂紅品種的聚類圖(見圖1)。在聚類圖上于遺傳相似系數(shù)0.63處可將62個供試品種分為 A、B、C、D、E、F 和 G 組。

表1 用于62個朱頂紅品種基因組DNA ISSR標記分析的引物序列及其擴增結(jié)果Table 1 Primer sequences used for ISSR marker analysis of genomic DNA of 62 cultivars of Hippeastrum spp.and their amplification results

A組共包含42個品種，大部分白色品種包含在此組中，包括供試品種中惟一的重瓣白色品種‘白孔雀’以及4個單瓣白色品種‘阿爾卑斯之角’、‘蒙特布朗’、‘雅典娜’和‘耀眼的路德維格’;4個單瓣白色品種僅在花瓣寬度和花瓣頂端卷曲度上有區(qū)別，其中‘雅典娜’和‘耀眼的路德維格’的形態(tài)特征極其相似。此組還包括重瓣純紅色品種‘紅孔雀’以及12個單瓣紅色品種和24個紅白相間品種。在24個紅白相間品種中，‘花邊香石竹’、‘紅里花邊香石竹’和‘約翰遜’這3個白色紅邊品種的形態(tài)特征極其相似，在圖1中被聚在一起，三者間的兩兩遺傳相似系數(shù)平均為0.814 3，處于較高水平，表明這3個品種具有較高的同源性。在供試的62個品種中，遺傳相似系數(shù)最高(0.842 9)的是編號為59號和60號的2個蘇州本地品種，在圖1中被聚在一起，表明兩者遺傳關(guān)系較近，且其形態(tài)特征幾乎完全一致，據(jù)此推測可能是早期不同地區(qū)引進的同一品種，但目前無法追尋它們的遺傳背景。

B組共包含10個品種，其中包括供試品種中惟一的綠色品種‘月光’，并與本組惟一的白色品種‘希望’聚在一起，兩者遺傳相似系數(shù)達到0.800 0，表明綠色品種與白色品種的遺傳關(guān)系較近，這與已知朱頂紅花色遺傳背景規(guī)律之一的“綠色和白色的花都沒有色素表達［13］”相符。此組還包含3個紅邊白條紋品種‘曼波樂曲’、‘雞尾酒’和‘承諾’，其中‘曼波樂曲’和‘雞尾酒’在形態(tài)上極其相似。另外還包含1個紅色重瓣品種‘丁克’和4個紅色品種‘當娜’、‘奧林帕斯’、‘小紅星’和‘波利舞曲’，其中‘當娜’、‘奧林帕斯’和‘小紅星’3個品種被聚在一起，可能是由于地域或來源一致等原因而具有較近的遺傳關(guān)系。

除上述2組外，其他幾組包含的品種均較少。C組包含‘鳳蝶’和‘卡門’2個品種，其中‘鳳蝶’具有花型花色較獨特及可常綠越冬等優(yōu)良性狀，是較原始的育種材料，與多數(shù)雜交種有親緣關(guān)系，目前仍然是朱頂紅育種的重要親本之一。D組只包含‘橙色塞維’1個品種，是較常見的單瓣紅色品種。E組包含‘安迪’、‘精靈’和‘圣誕禮物’3個品種，雖然聚在一起，但它們的遺傳相似系數(shù)均不大，‘安迪’和‘精靈’是重瓣紅白相間品種，而‘圣誕禮物’是供試品種中惟一不包含在A、B兩個大組中的單瓣白色品種。F組包含‘維拉’、‘舞蹈皇后’和‘俏皮玫瑰’3個品種，其中‘維拉’是較少見的全粉色品種。G組只包含‘小丑’1個品種，是觀賞性較高的單瓣紅白條紋品種。

從聚類圖中還可見:雖然供試的62個品種并沒有按照地域區(qū)分，也不是簡單地按照花瓣單重瓣及花色分組，但是有很多形態(tài)極其相似的品種被聚在一起，表明基于ISSR標記對朱頂紅品種進行遺傳關(guān)系分析是可行的。

2.3 ISSR指紋圖譜的構(gòu)建

2.3.1 特異標記確定 上述實驗結(jié)果表明:供試的62個朱頂紅品種的ISSR-PCR擴增產(chǎn)物多態(tài)性很高，僅有1個品種有1條特異性條帶，也僅有1個品種有1條特異缺失條帶(圖2)。在引物UBC873擴增圖譜上，品種‘小紅星’在450 bp處有1條特異性條帶，此條帶可用于品種‘小紅星’的鑒定;在引物UBC835的擴增圖譜上，品種‘精靈’在3 000bp處有1條特異缺失條帶，這一缺失條帶可用于品種‘精靈’的鑒定。

圖1 基于ISSR標記的62個朱頂紅品種的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of 62 cultivars of Hippeastrum spp.based on ISSR marker

2.3.2 指紋圖譜構(gòu)建 由于ISSR引物的多態(tài)性，采用同一引物擴增出的62個朱頂紅品種的條帶有明顯差異。比對結(jié)果表明:利用引物UBC835可以鑒別出50個朱頂紅品種，利用引物UBC873可以鑒別出44個朱頂紅品種，而采用引物UBC835和UBC873組合可以鑒別出供試的62個朱頂紅品種。

對上述2個引物的擴增圖譜進行形象化處理，在某一位點上有條帶的用黑方塊表示，無條帶則用白方塊表示，組合成供試62個品種的指紋圖譜(圖3)，利用此指紋圖譜，可以鑒定出使用特異性標記不能鑒別出的品種。

圖2 朱頂紅品種‘小紅星’和‘精靈’的ISSR標記特異譜帶Fig.2 Specific bands of ISSR marker for cultivars‘Xiaohongxing’and‘Elvas’of Hippeastrum spp.

圖3 基于引物UBC835和UBC873擴增結(jié)果的62個朱頂紅品種基因組DNA的ISSR指紋圖譜Fig.3 ISSR fingerprint of genomic DNA of 62 cultivars of Hippeastrum spp.based on amplification result by primers UBC835 and UBC873

3 討 論

目前，關(guān)于朱頂紅品種的遺傳背景知之甚少。本研究結(jié)果顯示:62個朱頂紅品種的ISSR片段多態(tài)性較高，不同品種間遺傳相似系數(shù)差異較大，說明在長期的進化過程中，朱頂紅品種在DNA分子水平上形成并保持了較高的變異，這可能與朱頂紅某些品種存在自交不結(jié)實現(xiàn)象有關(guān)。朱頂紅作為母本時的結(jié)實能力在一定程度上反映了該品種的園藝化程度，即越是原始的品種其結(jié)實能力越強，而經(jīng)過多次雜交和人工繁殖的品種其結(jié)實能力減弱。呂文濤等［14］對朱頂紅不同雜交和自交組合的研究結(jié)果表明:品種‘蘋果花’和‘粉色精華’作為母本時不結(jié)實，說明它們是園藝化程度比較高的品種，在多次反復雜交過程中，作為母本它們的結(jié)實能力下降到幾乎為零的水平;而品種‘貝貝星’、‘鳳蝶’、‘橙色塞維’、‘紅獅’、‘哈庫’和‘所羅門’作為母本時在雜交和自交的情況下均可結(jié)實，說明這6個品種是相對比較原始的朱頂紅品種。本研究結(jié)果表明:品種‘鳳蝶’與其他61個品種的遺傳相似系數(shù)平均值為0.655 4，而園藝化程度較高的品種‘蘋果花’為0.606 9，說明品種‘鳳蝶’在朱頂紅的園藝化過程中發(fā)揮了重要作用。

從聚類分析結(jié)果看，供試的62個朱頂紅品種沒有完全按照花的單重瓣特性或花色聚類，而基本上是根據(jù)遺傳相似系數(shù)混合聚成7組，但有許多形態(tài)極其相似的品種被聚在一起，表明基于ISSR標記對朱頂紅品種進行遺傳多樣性分析是可行的?！ㄟ呄闶瘛?、‘紅里花邊香石竹’和‘約翰遜’3個品種形態(tài)特征完全一致，很難辨別，利用ISSR標記得到三者的兩兩遺傳相似系數(shù)均為0.814 3，在聚類圖中聚在一起，與其形態(tài)特征具有一致性?；ㄇo較高較粗的朱頂紅品種‘蒙特布朗’和‘阿爾卑斯之角’以及花莖較細的朱頂紅品種‘雅典娜’、‘圣誕禮物’和‘希望’的花型及其花色等特征完全一致，平均遺傳相似系數(shù)分別為0.742 9和0.785 7，在62個品種間處于較高的水平。分析結(jié)果表明:在供試的62個朱頂紅品種中，白色單瓣品種中形態(tài)特征一致的品種均具有較高的遺傳相似系數(shù)(約0.8)，表明它們具有一定的遺傳相似性。因而，在實際引種時應避免引進形態(tài)類似的品種。另外，建議可將遺傳相似系數(shù)作為新品種確定的依據(jù)之一，遺傳相似系數(shù)大于一定數(shù)值的(如0.8以上)在確定新品種時應慎重。

在生產(chǎn)實踐中應用的朱頂紅栽培品種在園藝性狀上具有一定的差別，通常根據(jù)花色、花型和株型等特征進行區(qū)分。但很多形態(tài)相似品種從外部形態(tài)特征上根本無法鑒別，不僅花色花型一致，而且受栽培條件影響較大，其花期和葉片數(shù)等特征也幾乎無差別。本研究篩選出2個特異性條帶可以分別鑒別品種‘小紅星’和‘精靈’，而利用2個多態(tài)性高、重復性好的ISSR引物(UBC835和UBC873)構(gòu)建的指紋圖譜可以鑒別供試的62個品種。目前，運用ISSR標記進行品種鑒定已具有極大的應用前景，但在實際運用過程中，應對朱頂紅品種進行進一步的研究以期篩選出更多的特異性條帶，特別是應注重形態(tài)相似品種間的特異性條帶篩選，使這一鑒定方法的應用范圍更大、鑒定結(jié)果更準確和快捷。

致謝:蘇州大學蠶絲生物技術(shù)實驗室為本研究提供實驗條件，謹此致謝!

［1］BELL W D.New potentials in Amaryllis breeding［J］.Florida State Horticultural Society，1973，86:462-466.

［2］MEEROW A W，KANE M E，BROSCHAT T K.Breeding of new Hippeastrum cultivars using diploid species:the F-1 evaluation［J］.Florida State Horticultural Society，1990，103:168-170.

［3］張 敏，黃蘇珍，仇 碩，等.鳶尾屬植物遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析［J］.植物資源與環(huán)境學報，2007，16(2):6-11.

［4］劉本英，王麗鴛，周 健，等.云南大葉種茶樹種質(zhì)資源ISSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析［J］.植物遺傳資源學報，2008，9(4):458-464.

［5］李 梅，侯喜林，單曉政，等.部分桂花品種親緣關(guān)系及特有標記的ISSR分析［J］.西北植物學報，2009，29(4):674-682.

［6］鄭海燕，粟建光，戴志剛，等.利用ISSR和RAPD標記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(17):3499-3510.

［7］ZHAO W G，MIAO X X，ZANG B，et al.Constrction of fingerprinting and genetic diversity of Mulberry cultivars in China by ISSR Markers［J］.Acta Genetica Sinica，2006，33(9):851-860.

［8］繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波.85個大菊品種遺傳關(guān)系的ISSR分析［J］.園藝學報，2007，34(5):1243-1248.

［9］CHAKRABARTY D，GUPTA V N，DATTA S K.Varietal identification and assessment of genetic relationships in Hippeastrum using RAPD markers［J］.Plant Biotechnology Reports，2007，1:211-217.

［10］DOYLE J J，DOYLE J L.Isolation of plant DNA from fresh tissue［J］.Focus，1990，12:13-15.

［11］鞏振輝.園藝植物生物技術(shù)［M］.北京:科學出版社，2009.

［12］CAMACHO F J，LISTON A.Population structure and genetic diversity of Botrychium pumicola(Ophioglossaceoe)based on inter-simple sequence repeats(ISSR)［J］.American Journal of Botany，2001，88(6):1065-1070.

［13］呂英民，王有江.朱頂紅［M］.北京:中國林業(yè)出版社，2004:16-58.

［14］呂文濤，成海鐘，周玉珍，等.朱頂紅人工授粉的結(jié)實率與出苗率研究初報［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010(1):185-187.