馬英劍,李三強(qiáng)

撲熱息痛又名醋氨酚、對(duì)乙酰氨基酚，小劑量不會(huì)引起肝損傷，大劑量使用時(shí)，在其代謝過程中產(chǎn)生的大量N-乙酰-對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)超過了GSH的解毒能力，于是未被清除的NAPQI與生物大分子共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)巰基被氧化和芳香基化而影響它們的功能，從而導(dǎo)致肝損傷[1]。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs) 是一組廣泛存在于微生物和動(dòng)、植物體內(nèi)的生物進(jìn)化中高度保守的多肽蛋白。其中HSP70是HSPs 中最保守、最重要的一族,在大多數(shù)生物中含量最多，在應(yīng)激反應(yīng)中最敏感,因而是HSPs 中最受關(guān)注、研究最深入的一種[2]。本實(shí)驗(yàn)主要研究HSP70在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，進(jìn)一步深入探討HSP70在急性肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料健康清潔級(jí)昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量(22±2) g,由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；對(duì)乙酰氨基酚：廣州白云山制藥廠，用生理鹽水稀釋；HSP70鼠源性單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ALT、AST檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備 健康雄性小鼠40只分別腹腔注射對(duì)乙酰氨基酚溶液(用生理鹽水稀釋，550 mg/kg)，在注射對(duì)乙酰氨基酚后6，24，42，54 h分別眼球取血，分離血清測(cè)AST和ALT活性，同時(shí)取小鼠肝臟制備10%肝勻漿，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只小鼠。同時(shí)取10只正常小鼠的血清和肝臟作為對(duì)照進(jìn)行研究。

1.2.2 血清ALT、AST活性檢測(cè) 按試劑盒說明書操作，測(cè)定血清ALT、AST活性。

1.2.3 HSP70檢測(cè)室 利用考馬斯亮藍(lán)G250蛋白定量后取70 μg蛋白樣品經(jīng)SDS PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉、0.1%Tween20、PBS(PBST)室溫封閉膜30 min，用一抗HSP70(1∶1000)，37℃孵育1 h，PBST洗3次每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1000)于37℃孵育1 h，DAB顯色，檢測(cè)陽性信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1血清AST和ALT活性變化小鼠注射對(duì)乙酰氨基酚后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)血清中AST和ALT酶活性逐漸升高，24 h達(dá)到高峰，54 h逐漸恢復(fù)到正常水平，見圖1。

2.2 HSP70檢測(cè)結(jié)果HSP70在注射對(duì)乙酰氨基酚后6 h，其表達(dá)量略有增高，在24 h表達(dá)量達(dá)到高峰，說明小鼠肝臟的應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到了高峰，此后HSP70的表達(dá)量逐漸恢復(fù)到正常水平，見圖2。

圖2 小鼠注射對(duì)乙酰氨基酚后肝臟HSP70表達(dá)的變化

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過程HSP70的表達(dá)變化，并檢測(cè)了小鼠血清中AST和ALT活性的變化，初步闡明了HSP70在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中的作用。HSP70具有分子伴侶的作用，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于非正確的天然構(gòu)象的時(shí)候，那些存在于球狀蛋白質(zhì)內(nèi)部的非疏水性氨基酸將會(huì)暴露出來，將與一些肽、核酸分子和一些大分子發(fā)生不良的相互作用。作為分子伴侶，HSP70將會(huì)解決這一問題。當(dāng)新生的多肽一出現(xiàn)在核糖體中時(shí)，他們就結(jié)合到新生的多肽上，保護(hù)疏水的氨基酸殘基不進(jìn)行一些無效的相互作用[3-4]。HSP70作為分子伴侶，不斷的和蛋白質(zhì)結(jié)合或釋放，HSP70的構(gòu)象在發(fā)生著不斷地變化，這種變化是在ATP的水解和交換的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行的[5]。對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過程中，肝臟受到藥物的刺激，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，HSP70的表達(dá)量增高以幫助錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)肝臟的修復(fù)和再生。總之，本研究為進(jìn)一步闡明HSP70在急性肝損傷中的重要作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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