王 永，孫軍君，郭孝龍，段勇剛，常書峰，史保中

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachniod hemorrhage, SAH)是神經(jīng)科的一種常見急重癥，交通性腦積水是其常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，致殘率高，目前研究認(rèn)為其與蛛網(wǎng)膜的纖維化導(dǎo)致的腦脊液吸收障礙有關(guān)[1]。應(yīng)用抗纖維化藥物減少SAH后蛛網(wǎng)膜纖維化，從而降低或預(yù)防慢性腦積水的發(fā)生，已作為一種治療手段在實驗與臨床應(yīng)用中得到證實。己酮可可堿(pentoxifylline, PTX)是甲基黃嘌呤的衍生物，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，以往多用于心腦血管病的治療，近年來發(fā)現(xiàn)其還具有抗纖維化作用且日益受到重視，并在心、腎、肺、肝纖維化疾病及瘢痕組織的治療中得到應(yīng)用，但其對蛛網(wǎng)膜纖維化的作用目前尚未見報道。本實驗通過枕大池兩次注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，應(yīng)用己酮可可堿干預(yù)后檢測腦脊液中TGF-β1的濃度變化；21 d處死取腦，行Masson染色觀察蛛網(wǎng)膜膠原纖維含量，初步探討己酮可可堿對SAH后蛛網(wǎng)膜纖維化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物室提供清潔級健康新西蘭大白兔55只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。隨機分為空白組15只、模型組20只、己酮可可堿干預(yù)組20只。

1.2試劑及儀器戊巴比妥鈉(武漢博士德公司)；兔轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)定量檢測試劑盒(ELISA)[上海藍(lán)基(啟迪)生物技術(shù)有限公司]；PTX注射液(石家莊四藥有限公司，規(guī)格：5 mL，0.1 g，批號：20110203)；北航CMIAS4.0/4.1多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室提供)。

1.3動物模型制作采用枕大池兩次注血法建立兔SHA模型。提前1 d將穿刺部位備皮，首先用戊巴比妥鈉30 mg/kg經(jīng)耳緣靜脈將兔子麻醉，兔子取俯臥位固定于手術(shù)架上，備皮部位消毒鋪巾，用自制穿刺針(0.55×20號精密輸液器套于1 mL注射器內(nèi)，注射器前端針頭留長約15 mm)在枕骨大孔上緣沿正中矢狀面于枕骨平面成45°夾角緩慢進針，待穿刺針有落空感，進針2～3 mm，緩慢抽出1 mL腦脊液后，快速取耳中動脈非抗凝血，按照1.0 mL/kg緩慢注入枕大池，注入時間1 min左右。注入完畢后，將兔置于頭低位約30 min。術(shù)后24 h重復(fù)同樣操作?？瞻捉M只抽取腦脊液，PTX干預(yù)組是在模型的基礎(chǔ)上從第2天開始給予PTX 8 mg/kg，每天鞘內(nèi)注射治療，持續(xù)10 d。

1.4腦脊液測定分別在第3、7、11、16、21天時間點取腦脊液。將動物麻醉后緩慢抽取1.0 mL腦脊液(操作方法同前)，標(biāo)本均立即存于-80℃冰箱保存待測。用ELISA法測定腦脊液中TGF-β1濃度，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒上說明進行。

1.5動物標(biāo)本制取及Masson染色模型組在制模成功后處死4只，觀察蛛網(wǎng)膜下腔出血，其余動物在第21天全部處死取腦。戊巴比妥鈉麻醉后，兔子仰臥固定于手術(shù)架上，開胸阻斷胸主動脈，18G套管穿刺針穿刺左心室，剪開右心房，37℃生理鹽水灌洗至流出無色液體后，4%多聚甲醛固定，小心咬除顱骨取出腦組織，放入Bouin固定液中固定72 h后，沖洗，取大腦凸面腦膜完整處脫水，透明，石蠟包埋，切片，Masson染色觀察。測蛛網(wǎng)膜厚度及平均灰度值，進定量分析，以100×厚度/灰度值作為衡量膠原纖維含量的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1腦脊液中TGF-β1的濃度變化模型組和干預(yù)組腦脊液中TGF-β1的濃度在第3天和第16天出現(xiàn)兩個高峰，但干預(yù)組較模型組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空白組無明顯改變，見表1。

表1 各組在各個時間點所測得腦脊中TGF-β1濃度值對比 pg/L

2.2蛛網(wǎng)膜Masson染色病理觀察結(jié)果切片染色顯示：①硬腦膜、蛛網(wǎng)腦膜明顯藍(lán)染，硬膜尤為明顯；②腦組織各層均無藍(lán)染；③模型組的蛛網(wǎng)腦膜明顯增厚，蛛網(wǎng)膜下腔發(fā)生黏連較多，Masson染色較深，④PTX干預(yù)組蛛網(wǎng)膜厚度介于模型組和空白組之間，蛛網(wǎng)膜下腔發(fā)生黏連較模型組少，Masson染色較模型組淺。經(jīng)CMIAS 4.0/4.1多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)測量蛛網(wǎng)膜的灰度值及厚度，模型組灰度值低于空白組(P<0.05)，厚度值大于空白組(P<0.05)，膠原纖維含量大于空白組(P<0.05)；PTX干預(yù)組灰度值高于模型組(P<0.05)，厚度值小于模型組(P<0.05)，膠原纖維含量小于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 蛛網(wǎng)膜纖維膠原病理圖像分析結(jié)果

3 討論

慢性腦積水是蛛網(wǎng)膜下腔出血后的常見慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致患者死亡。其形成機制目前尚未完全明確。目前研究多認(rèn)為與血液刺激、炎癥介質(zhì)釋放導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜及蛛網(wǎng)膜下腔纖維化影響腦脊液吸收有關(guān)[2]。有研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后，蛛網(wǎng)膜中HA、LN、PIIINP的含量明顯增多，表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后蛛網(wǎng)膜存在纖維增生現(xiàn)象，這可能是蛛網(wǎng)膜下腔出血后慢性腦積水形成的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。Sajanti等發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中I型原膠原(PICP)和PIIINP明顯升高[3-4]。目前臨床上應(yīng)用地塞米松降低蛛網(wǎng)膜纖維化的程度，從而減少腦積水的發(fā)生率。但該種方法效果有限，且副作用明顯。

PTX分子式是C13H20N4O3，化學(xué)名為3，7-二甲基黃嘌呤，是甲基黃嘌呤的衍生物，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，能阻斷cAMP轉(zhuǎn)變?yōu)锳MP，以往多用于心腦血管病的治療，近年來發(fā)現(xiàn)其還具有抗纖維化作用，且日益受到重視，并在心、腎、肺、肝纖維化疾病及瘢痕組織的治療中得到應(yīng)用。本實驗通過鞘內(nèi)注射給藥，研究PTX對SAH后蛛網(wǎng)膜纖維化的作用，結(jié)果表明，PTX干預(yù)組蛛網(wǎng)膜纖維化程度明顯降低，腦脊液中TGF-β1濃度明顯降低，提示PTX能夠減輕SAH后蛛網(wǎng)膜纖維化，為臨床預(yù)防和治療SAH后腦積水的發(fā)生提供借鑒。

研究表明腦脊液中TGF-β1增高在SAH后蛛網(wǎng)膜纖維化過程中起重要作用。TGF-β1是一種纖維源性細(xì)胞因子，不存在于正常腦脊液中[5]。SAH時進入蛛網(wǎng)膜下腔的血小板、膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥反應(yīng)都可釋放TGF-β1到腦脊液中。Motohashi等發(fā)現(xiàn)TGF-β1經(jīng)一系列信號傳遞增加了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的積聚，導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜黏連、增厚，使蛛網(wǎng)膜下腔、蛛網(wǎng)膜絨毛及其他表淺的血管間隙、神經(jīng)根周圍間隙纖維增生，發(fā)生閉塞，引起腦脊液回流和吸收障礙。TGF-β1還能促使軟腦膜細(xì)胞增殖，具有刺激腦脊液增多的作用[6]。這與本實驗中模型組腦脊液中TGF-β1明顯升高，蛛網(wǎng)膜纖維增生程度明顯的結(jié)論相符。

PTX能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的蛛網(wǎng)膜細(xì)胞膠原mRNA上調(diào)，從而降低膠原纖維的合成，能逆轉(zhuǎn)TGF-β1的促使各種間質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)增殖和分泌的作用，可以起抑制肝臟、腎臟、肺臟、皮膚等多種器官纖維化及硬化的作用。而蛛網(wǎng)膜細(xì)胞是特化的成纖維細(xì)胞[7]，因而能夠應(yīng)用PTX來減少SAH后腦脊液中TGF-β1合成和釋放，從而減低蛛網(wǎng)膜纖維化。PTX的抗纖維化作用還可能通過抑制細(xì)胞增生、抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌、抑制炎癥反應(yīng)、清除自由基等途徑發(fā)揮作用[8]。通過對PTX抗蛛網(wǎng)膜纖維化發(fā)生機制的研究，將有助于理解SAH后慢性腦積水的形成原因，為防治腦積水提供新的思路和手段。

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