張?zhí)鹛穑?陳存社， 侯建軍， 任雅琳

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

蝸牛水解液的制備及其乳酸發(fā)酵飲料的研究

張?zhí)鹛穑?陳存社， 侯建軍， 任雅琳

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

用堿性蛋白酶對(duì)白玉蝸牛肉進(jìn)行水解，探討了水解溫度、pH值、加酶量及固液比對(duì)蝸牛肉水解液水解得率的影響，通過正交試驗(yàn)確定了蝸牛肉水解的較佳條件，并以水解液為原料進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，獲得較佳的飲料制備工藝．結(jié)果表明:以堿性蛋白酶為水解酶，水解工藝條件為，溫度50℃，pH 10.5，料液比1∶5，加酶量6 000 U/g，水解3 h后加1%風(fēng)味蛋白酶水解1 h時(shí)水解度為7.13%．水解液乳酸菌發(fā)酵的較佳工藝條件為:115℃高溫滅菌15 min，蔗糖添加量5%，乳糖添加量2%，乳酸菌接種量3% ～4%，時(shí)間6 h．

蝸牛;水解度;發(fā)酵;飲料

白玉蝸牛，也稱褐云瑪瑙螺，是陸生貝殼類的軟體動(dòng)物，屬腹足綱，原產(chǎn)于非洲東部．白玉蝸牛肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有20多種氨基酸 ，可以加工為多種食品和保健品，具有較高的食用和藥用價(jià)值［1－2］．據(jù)分析:100 g褐云瑪瑙螺干肉含蛋白質(zhì)60.42 g，脂肪 3.85 g，粗纖維 4.5 g，無(wú)氮浸出物18.9 g，灰分 9.6 g，以及鈣、磷、生物堿、酚類、鞣酸、肉酯、香豆精、有機(jī)酸和維生素等，還含有大量的硒、硼、鋅等微量元素［3］．以蝸牛肉為原料 ，采用酶解生產(chǎn)的蝸牛蛋白水解液，還可用作高級(jí)調(diào)料或調(diào)配成保健品直接飲用［4］．此外，蝸牛肉經(jīng)過酶解得到的蝸牛全營(yíng)養(yǎng)液蛋白質(zhì)和氨基酸含量高，適當(dāng)添加該提取液可以提高食品、化妝品的價(jià)值［5－7］．

我國(guó)是蝸牛養(yǎng)殖大國(guó)，資源極為豐富．蝸牛主要以烹調(diào)為主，少量用于藥品和其他方面．目前，市場(chǎng)上主要的蛋白水解液為植物蛋白水解液，其氨基酸組成和比例都與人體需求差異較大．動(dòng)物蛋白水解液與人體氨基酸組成相似，但由于原料安全得不到保障，市場(chǎng)上動(dòng)物源水解液較少．宋煥祿［8］等利用鹽酸水解蝸牛肉粉后中和得到的蝸牛蛋白水解液蛋白水解率高，氨基酸態(tài)氮得率達(dá)50%．郭玉華［9］和白鳳翎［10］利用菠蘿蛋白酶水解牡蠣蛋白，并用乳酸菌發(fā)酵水解液得到乳酸發(fā)酵飲料，其中含有大量的低分子多肽，易吸收，而且蛋白水解物也能促進(jìn)乳酸菌的增殖．劉姝［11］等利用米曲霉 Aspergillus oryzae AS3.951發(fā)酵太平洋牡蠣，制備水解液，也是動(dòng)物水解液的新探索．張昌奎［12］等利用Protamex Flavourzyme酶水解蝸牛肉并對(duì)水解液進(jìn)行了脫色和脫腥研究，得到色澤淺、無(wú)腥味的蛋白水解液．利用堿性蛋白酶水解蝸牛肉的研究較少，并且利用蝸牛肉水解液進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵得到發(fā)酵飲料也是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)．利用酶水解的動(dòng)物蛋白水解液不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，口味較好，其乳酸菌發(fā)酵飲料也利于腸道吸收，可以實(shí)現(xiàn)蝸牛的高值化利用，為蝸牛乳酸菌飲料的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料

白玉蝸牛，購(gòu)自北京市海淀區(qū)四道口水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng);脫脂奶粉，完達(dá)山產(chǎn)品(批號(hào):3601B412);脫脂牛奶培養(yǎng)基，用于菌種活化和短期傳代保存．

1.1.2 酶制劑

堿性蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限公司，活力20萬(wàn)U/g;風(fēng)味蛋白酶，諾維信公司．

1.1.3 試劑

乳糖、蔗糖，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1.1.4 菌種

嗜熱鏈球菌(S．theumopHilus，St)，由中科院微生物所提供;

保加利亞乳桿菌(L．bulgaricus，Lb)，由中科院微生物所提供．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DS－1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠 ;HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，杰瑞爾電器有限公司;PHS－3D型精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HJ－1型磁力攪拌器，江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;Scout型電子天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;LRH－250型生化恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;高剪切均質(zhì)乳化機(jī);上海世赫機(jī)電設(shè)備有限公司;Himac CR22G型高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝸牛蛋白的酶水解［4］

將靜養(yǎng)2 d的蝸牛用水清洗干凈，放入沸水中，30 s后取出，將蝸牛肉取出，稱取一定量的蝸牛肉加入不同比例去離子水，用絞肉機(jī)將蝸牛肉絞碎．調(diào)節(jié)蝸牛肉的pH值，以堿性蛋白酶為水解酶，在不同的水解溫度、加酶量和固液比條件下分別酶解3 h，加入1%的風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解1 h以改善酶解液風(fēng)味［13］．酶解液95℃水浴5 min滅酶，酶解液5000 r·min－1離心 10 min 后得清液備用．

1.3.2 蝸牛蛋白水解條件優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用堿性蛋白酶的水解溫度、pH值、酶添加量和固液比作為試驗(yàn)因素，如表1．選取L9(34)正交試驗(yàn)探討堿性蛋白酶水解的較佳工藝條件．

1.3.3 水解度的測(cè)定

分別采用凱氏定氮法［14］和中性甲醛滴定法［15］測(cè)定蝸牛肉蛋白總氮含量和水解液中游離氨基態(tài)氮含量．

表1 L9(34)堿性蛋白酶水解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab．1 Design of L9(34)alkali protease hydrolysis orthogonal test

1.3.4 蝸牛水解液的調(diào)配

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)發(fā)酵蝸牛酶解液時(shí)因糖的缺乏會(huì)導(dǎo)致乳酸菌不能很好地生長(zhǎng)繁殖，也不能產(chǎn)生足夠的乳酸，加入蔗糖、乳糖可使乳酸菌充分生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸，增加產(chǎn)酸量［16］．因此添加不同濃度的蔗糖和乳糖調(diào)配后滅菌進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵．

1.3.5 蝸牛水解液乳酸菌發(fā)酵［17］

根據(jù)發(fā)酵型乳酸菌飲料制備方法，將獲得的蝸牛水解離心上清液，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖和乳糖調(diào)配，在115℃高溫滅菌15 min，冷卻后按嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的比例為St∶Lb=1∶1，接種量為3% ～4%，42 ℃培養(yǎng)，分別發(fā)酵 4，5，6，7，8 h．測(cè)定發(fā)酵液的pH值和酸度，并進(jìn)行感官評(píng)分．

1.3.6 滅菌溫度對(duì)蝸牛乳酸菌發(fā)酵飲料的影響實(shí)驗(yàn)

為確定蝸牛水解液發(fā)酵飲料的最佳滅菌溫度，將蝸牛水解液添加一定量白砂糖和乳糖調(diào)配后分別在115℃和120℃滅菌15 min，迅速冷卻，觀察蝸牛水解液的狀態(tài)．

1.3.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵型蝸牛乳酸菌飲料的影響實(shí)驗(yàn)

為研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)蝸牛水解液發(fā)酵飲料產(chǎn)品的質(zhì)量和口感的影響，將水解液調(diào)配后滅菌，接種乳酸菌后在42 ℃發(fā)酵 4，5，6，7，8 h，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液pH值和酸度，并進(jìn)行感官評(píng)分．

1.3.8 發(fā)酵液酸度的測(cè)定

分別采用pH計(jì)和滴定法［18］測(cè)定乳酸菌發(fā)酵液的pH值和酸度．

1.3.9 發(fā)酵液沉淀率SR的測(cè)定［19］

在產(chǎn)品貯藏幾天后，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行離心沉淀測(cè)試．稱取10 mL樣品到離心管中，常溫下以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)10 min，離心后倒出上層液體，再將離心管倒置5 min后稱重．每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定，結(jié)果取平行測(cè)定的平均值．

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性蛋白酶水解條件的優(yōu)化結(jié)果

堿性蛋白酶水解蝸牛肉的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2．由表2可以看出，影響水解度的主次因素是:D＞A＞B＞C，即固液比＞水解溫度＞pH＞加酶量．試驗(yàn)結(jié)果表明，水解得率最高的酶解工藝組合為A3B2C1D1，水解度為7.13%．因此確定了堿性蛋白酶水解蝸牛肉的較佳酶解條件:水解溫度50℃，pH 10.5，料液比1∶5，加酶量 6 000 U/g，為改善蝸牛水解液的風(fēng)味，在堿性蛋白酶水解3 h后加入1%風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)水解1 h．

表2 L9(34)堿性蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 L9(34)Alkali protease hydrolysis orthogonal test results

2.2 蝸牛水解液乳酸飲料發(fā)酵結(jié)果分析

2.2.1 蝸牛水解液調(diào)配中乳糖添加量對(duì)蝸牛乳酸發(fā)酵飲料的影響

蝸牛酶水解液中含糖量較少，發(fā)酵蝸牛水解液時(shí)因糖的缺乏會(huì)導(dǎo)致乳酸菌不能很好地生長(zhǎng)繁殖，因此也不能產(chǎn)生足夠的乳酸．加入蔗糖、乳糖可使乳酸菌充分生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸，增加產(chǎn)酸量．加入不同含量乳糖和蔗糖后蝸牛乳酸菌發(fā)酵6 h后的pH值、酸度和感官評(píng)價(jià)如表3和表4．

由表3看出，隨著乳糖添加量的增加，滴定酸度逐漸增加，當(dāng)乳糖添加量大于2%時(shí)，滴定酸度上升趨勢(shì)比較緩慢，因此乳糖添加量在2%時(shí)較佳．

表3 乳糖添加量對(duì)蝸牛乳酸菌發(fā)酵飲料的影響Tab．3 Effect of lactose content on snail lactobacillus fermented beverage

表4 蔗糖添加量對(duì)蝸牛乳酸菌發(fā)酵飲料的影響Tab．4 Effect of sucrose content on snail lactobacillus fermented beverage

加入適當(dāng)?shù)恼崽强梢詾槿樗峋峁┨荚?，促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸，增加產(chǎn)酸量，使產(chǎn)品產(chǎn)生良好的風(fēng)味和口感．若添加量過大，會(huì)產(chǎn)生高滲透壓，抑制乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖;添加量過小，風(fēng)味較差．由表4可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，感官評(píng)分升高，當(dāng)蔗糖添加量為5%，感官評(píng)分較高，與蔗糖添加量為7%的感官評(píng)分無(wú)顯著性差異．

2.2.2 滅菌溫度對(duì)蝸牛乳酸菌發(fā)酵飲料的影響

為研究滅菌溫度對(duì)蝸牛乳酸菌發(fā)酵飲料的影響，將蝸牛水解液添加一定量蔗糖和乳糖調(diào)配后，分別在115℃和120℃條件下滅菌，持續(xù)15 min，迅速冷卻，觀察蝸牛水解液的狀態(tài)．發(fā)現(xiàn)在115℃滅菌后蝸牛液的色澤較好，無(wú)沉淀，在120℃滅菌后有大量褐色沉淀，因此確定蝸牛水解液的滅菌條件為115 ℃，15 min．

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵型蝸牛乳酸菌飲料的影響

將調(diào)配好的蝸牛水解液滅菌后，接種乳酸菌發(fā)酵，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液pH值和酸度，并進(jìn)行感官評(píng)分，結(jié)果見表5．

由表5可見，發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量和口感都有較大的影響，時(shí)間過短，風(fēng)味不足，口感較差;時(shí)間過長(zhǎng)，產(chǎn)酸量過多，風(fēng)味不佳，生產(chǎn)效率較低，生產(chǎn)成本過高．當(dāng)然，最佳的發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵劑的活力和發(fā)酵溫度有密切關(guān)系，生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定．從表5綜合考慮感官評(píng)分和生產(chǎn)效率，時(shí)間達(dá)6 h為較佳發(fā)酵時(shí)間．

表5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蝸牛乳酸菌發(fā)酵飲料的影響Tab．5 Effect of fermentation time on snail lactobacillus fermented beverage

2.2.4 蝸牛水解發(fā)酵飲料出現(xiàn)的問題

通過多次蝸牛水解發(fā)酵飲料的制備實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蝸牛發(fā)酵飲料會(huì)出現(xiàn)沉淀和分層現(xiàn)象．產(chǎn)品貯藏幾天后，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行離心沉淀測(cè)試．發(fā)現(xiàn)調(diào)配好的蝸牛水解液在42℃發(fā)酵9 h，冷凍12 h后沉淀率達(dá)2.3%，而一般地，產(chǎn)品離心沉降率在1%以內(nèi)認(rèn)為比較穩(wěn)定［20］，大于1%的，越大越不穩(wěn)定．為降低飲料的沉淀率和提高發(fā)酵飲料的穩(wěn)定性［21］，在飲料中加入不同含量的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，發(fā)現(xiàn)隨著CMC-Na添加量增加，離心沉淀率先降低后增加，穩(wěn)定劑的添加量超過一定值時(shí)，反而引起乳酸菌發(fā)酵飲料更加不穩(wěn)定，其主要原因可能是，穩(wěn)定劑加入過多，飲料顆粒表面吸附的穩(wěn)定劑鏈節(jié)數(shù)會(huì)過多或鏈節(jié)的吸附占極大優(yōu)勢(shì)，沉淀會(huì)從穩(wěn)定劑分子上解吸［22］．

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用堿性蛋白酶對(duì)白玉蝸牛肉水解，并通過正交試驗(yàn)對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了蝸牛肉水解的較佳條件．蝸牛水解液中含有大量的短分子多肽，利用蝸牛水解液添加5%蔗糖和2%乳糖調(diào)配的蝸牛水解液滅菌后接種乳酸菌發(fā)酵，并研究了乳糖和蔗糖添加量對(duì)乳酸發(fā)酵飲料口味的影響．發(fā)現(xiàn)在蔗糖添加量5%，乳糖添加量2%，乳酸發(fā)酵飲料的酸度和口味較好．在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了蝸牛水解液在發(fā)酵過程中的沉淀和不穩(wěn)定問題．發(fā)酵型蝸牛飲料的營(yíng)養(yǎng)成分分析和其貯存過程中出現(xiàn)的問題將是以后研究中應(yīng)重點(diǎn)研究的方向．此外蝸牛乳酸菌飲料的保健作用也有待進(jìn)一步研究．

［1］陳曾逸．蝸牛系列產(chǎn)品開發(fā)與利用［J］．農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，1996(9):11-13．

［2］黃振東，嚴(yán)得勝．蝸牛［J］．生物學(xué)通報(bào)，2002，37(12):16．

［3］沈忠明．出口褐云瑪瑙螺蝸牛肉干營(yíng)養(yǎng)成分的研究［J］．四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，13(4):33-37．

［4］張昌奎，唐家禮，譚汝成．改善蝸牛肉蛋白水解液色澤和風(fēng)味的研究［J］．廣州食品工業(yè)科技，2000(4):48-49．

［5］烏力吉．全蝸牛營(yíng)養(yǎng)液提取改進(jìn)工藝:中國(guó)，CN 1119534［P］．1996-04-03．

［6］Brieva A，Guerrero A，Pivel J P．Biochemical and pharmacological mechanism related to the activity of cryptomphalus aspersa(SCA)(Endocare?)in radiodermatitis［J］．Dermatol Cosmet，2001，11(2):71-75．

［7］Smith A M，Callow J A．Biological adhesives［M］∥The biochemistry and mechanics of gastropod adhesive gels．Heidelberg:Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH ＆ Co KG，2006:167-182．

［8］宋煥祿，劉雪妮，陳功如．一種蝸牛蛋白水解液及其制備方法:中國(guó)，201110165244［P］．2011-12-21．

［9］郭玉華．牡蠣乳酸菌發(fā)酵飲料研制及其免疫活性的研究［D］．青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2008．

［10］白鳳翎．蛋白水解物促乳酸菌增殖及高密度培養(yǎng)體系研究［D］．北京:北京林業(yè)大學(xué)，2010．

［11］劉姝，房耀維，王淑軍，等．微生物發(fā)酵法制備太平洋牡蠣水解液［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(3):105-108．

［12］張昌奎，唐家禮，譚汝成．改善蝸牛肉蛋白水解液色澤和風(fēng)味的研究［J］．廣州食品工業(yè)科技，2000(4):48-49．

［13］曹川，朱文廣，包建強(qiáng)．貽貝肉酶解液的脫苦脫腥研究［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2):216-218．

［14］全國(guó)飲料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)．GB/T 6432—1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法［S］．北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994．

［15］衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所．GB 5009.5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］．北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010．

［16］曾傳廣，余有貴．米皮水解液發(fā)酵乳酸菌飲料的工藝研究［J］．中國(guó)釀造，2008(9):100-102．

［17］徐 瑩，劉文磊，姜?jiǎng)P元，等．牡蠣蘿卜汁的乳酸菌發(fā)酵研究［J］．中國(guó)釀造，2010(5):85-88．

［18］黃偉坤．食品檢驗(yàn)與分析［M］．北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1989:49-52．

［19］趙宇星．發(fā)酵型酸豆乳飲料的研究［D］．無(wú)錫:江南大學(xué)，2005．

［20］楊海紅．卡拉膠及糖、鹽存在時(shí)對(duì)勾對(duì)牛奶酒穩(wěn)定性的影響［J］．無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(1):29-30．

［21］趙曉麗，李潔慧，宮春波，等．穩(wěn)定劑添加對(duì)發(fā)酵型酸奶發(fā)酵效果的影響［J］．中國(guó)食品添加劑，2011(1):182-186．

［22］李彥榮．果汁豆奶的制備及其穩(wěn)定性研究［D］．無(wú)錫:江南大學(xué)，2006．

(責(zé)任編輯:葉紅波)

Study on Preparation of Snail Hydrolyzate and Application in Fermentation Beverage

ZHANG Tian-tian， CHEN Cun-she， HOU Jian-jun， REN Ya-lin
(School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Hydrolysis of snail meat with alkali protease was determined by orthogonal test and the application of snail hydrolyzate in fermentation beverage were studied．The optimal conditions of snail meat hydrolysis were temperature 50℃，pH 10.5，solid-liquid rate 1∶5，and alkali protease dosage of 6000 U/g．After 3 h of hydrolysis，1%of flavourzyme was added to improve the flavor．Supernatant of hydrolyzate was sterilized at 115℃ for 15 min．With fermentation at temperature 40℃，sugar 5%，inoculum 3% －4%，and lactose 2%for 6 h，the beverage obtained had good color and flavour，and also showed high stability．

snail;degree of hydrolysis;fermentation;beverage

TS251;TS275.4

A

1671-1513(2012)06-0063-04

2012-02-22

北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(KZ20110011013);學(xué)科與研究生教育重點(diǎn)學(xué)科應(yīng)用化學(xué)資助項(xiàng)目(PXM2012_014213_000038)．

張?zhí)鹛?，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程;

陳存社，男，教授，博士，主要從事發(fā)酵食品方面的研究．通訊作者．