潘廣彥， 朱傳合， 喬聚林， 鄭振佳

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018)

快速高分離液相色譜/四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析山楂籽中的主要黃酮成分

潘廣彥， 朱傳合， 喬聚林， 鄭振佳

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018)

采用快速高分離液相色譜/四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(RRLC/Q-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行山楂籽中的黃酮類化合物分析方法研究．山楂籽黃酮經(jīng)超聲輔助提取后，選用Welch Materials C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相組成分別為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫．在正離子模式下，經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜分離并檢測(cè)了15種黃酮成分．結(jié)果表明，快速分離液相-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以快速準(zhǔn)確鑒定樣品中的黃酮成分．

快速高分離液相色譜/四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜;山楂籽;黃酮

山楂是薔薇科山楂屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥與水果．現(xiàn)代藥理研究表明，山楂中黃酮類化合物具有很好的醫(yī)療和保健作用［1］．傳統(tǒng)注重果實(shí)、葉方面的研究，但近幾年隨著提取工藝和檢測(cè)手段的提高，對(duì)山楂籽的研究有了很大進(jìn)展，尤其是山楂籽中的黃酮，對(duì)心血管系統(tǒng)有良好的治療保健作用，是開(kāi)發(fā)黃酮的優(yōu)質(zhì)資源［2－4］．目前，山楂及其副產(chǎn)品中黃酮的檢測(cè)方法有分光光度法、高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法等［5－9］．但是，以上檢測(cè)方法中分析操作檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，而且測(cè)定的結(jié)果容易受到干擾，穩(wěn)定性差，往往不能滿足快速鑒定分析的要求．

飛行時(shí)間質(zhì)譜具有檢測(cè)靈敏度高，測(cè)定化合物質(zhì)荷比精確，離子掃描范圍寬等優(yōu)點(diǎn)［10－11］，是一種新興且發(fā)展迅速的質(zhì)譜技術(shù)．為了進(jìn)一步提高靈敏度或分辨率，飛行時(shí)間質(zhì)譜與氣相色譜、液相色譜、電泳、離子阱及其他質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)已成為研究的熱點(diǎn)．近年來(lái)，快速分離液相-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物、中藥復(fù)方分析、生命科學(xué)等領(lǐng)域［12－15］，逐漸成為植物活性成分定性定量分析的有力的工具，是近幾年來(lái)應(yīng)用最廣的質(zhì)譜分析技術(shù)之一．

本研究采用快速高分離液相色譜/四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(rapid resolution liquid chromatography/quadrupole-time offlightmass spectrometer，RRLC/Q-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)山楂籽中的黃酮類化合物進(jìn)行快速的分析鑒定．該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，而且無(wú)需對(duì)照品，有利于在生產(chǎn)中對(duì)山楂籽黃酮類產(chǎn)品的質(zhì)量控制，為山楂副產(chǎn)品資源的深度開(kāi)發(fā)、綜合利用及延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈提供技術(shù)支持．

1 儀器與試劑

Agilent 1200RRLC/6520型快速高分離液相/四級(jí)桿－飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司;乙腈為色譜純，HPLC級(jí)甲酸，美國(guó)Tedia公司;甲醇為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水;山楂籽(山楂產(chǎn)自泰安)，經(jīng)軟化打漿后沖洗晾干，粉碎至60目待用．

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取山楂籽粉末1.0 g，于50 mL具塞試管木糖-8-C-葡萄糖芹菜素［vicenin 1(6-C-xylosyl-8-C-glucosyl apigenin)］、大波斯菊苷(7-O-glucoside apigenin)、6-C-hexoside-8-C-pentosideApigenin、6-C-阿拉伯糖-8-C葡萄糖芹菜素(isoschaftoside)、6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖芹菜素(schaftoside)、8-甲氧基山萘酚(8-methoxy kaempferol)．中，加入10 mL甲醇，混勻，室溫下超聲提取15 min，3 500 r/min 離心 15 min，取上清液，過(guò) 0.22 μm 濾膜，作為實(shí)驗(yàn)樣品．

2.2 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱為 Welch Materials C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)是0.1%甲酸的水溶液;流速1 mL/min;進(jìn)樣體積20 μL;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm．流動(dòng)相線性梯度洗脫如表1．

表1 線性梯度洗脫表Tab．1 Procedure of linear gradient elution %

2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源ESI，正離子模式掃描，質(zhì)量掃描范圍100～1 000m/z，毛細(xì)管電壓4 000 V，四極桿溫度100℃，霧化壓力3.45×105Pa(50 psi)，干燥氣流量10 L/min，干燥器溫度350℃，碎裂電壓175 V．

3 結(jié)果與討論

3.1 條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相體系中加入適量甲酸可有效抑制酸性化合物的拖尾，更利于增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)，從而提高靈敏度．實(shí)驗(yàn)考察了甲酸的添加量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水中添加體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸有效的抑制酸類物質(zhì)的拖尾現(xiàn)象．質(zhì)譜檢測(cè)分別采用了正、負(fù)離子2種掃描模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正離子模式下峰面積更大、質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，比負(fù)離子模式更加靈敏，因此本實(shí)驗(yàn)采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)．山楂籽提取液RRLC/Q-TOF MS的總離子流圖見(jiàn)圖1．

圖1 山楂籽提取液的總離子流圖Fig．1 Total ion chromatogram of extracts of hawthorn seed

3.2 山楂籽中黃酮類化合物的分析

本實(shí)驗(yàn)采用RRLC/Q-TOF獲得了山楂籽醇溶性成分的分子離子峰及其精確分子量，見(jiàn)圖2．根據(jù)得到山楂籽醇溶性化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)合山楂植物化學(xué)成分研究報(bào)道，參考相關(guān)文獻(xiàn)收集了山楂植物中黃酮類化合物共60個(gè)［16］，并以此為依據(jù)對(duì)15種黃酮類化合物進(jìn)行鑒定．根據(jù)圖2由文獻(xiàn)推斷山楂籽黃酮的成分如下．

峰1(圖2f)獲得 m/z 433.146 6［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰2(圖2l)獲得m/z 579.150 9［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰3(圖2e)獲得m/z 433.146 4［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰4(圖2k)獲得m/z 579.149 9［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰6(圖2n)獲得 m/z 611.243 0［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰7(圖2o)獲得m/z 615.242 9［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰8(圖2h)獲得m/z 565.206 0［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰9(圖2d)獲得m/z 417.153 6［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰10(圖2j)獲得m/z 565.2065［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰11(圖2i)獲得m/z 565.2061［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰12(圖2g)獲得 m/z 547.360 4［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰15(圖2c)獲得m/z 317.208 5［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，根據(jù)文獻(xiàn)［17－18］推斷其分別為:異牡荊素(iso-vitexin)、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷(vitexin-2″-O-rhamnoside)、牡荊素(vitexin)、牡荊素-4'-O-鼠李糖苷(vitex-in-4'-O-rhamnoside)、木犀草素類-3'，7-二葡萄糖糖苷(luteolin-3'，7-diglucoside)、2″-O-鼠李糖葒草素(2″-O-rhamnoside-orientin)、6-C-

圖2 山楂籽黃酮的質(zhì)譜圖Fig．2 Mass spectra of hawthorn seed extracts

峰5(圖2a)獲得m/z 433.146 4［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，峰13(圖2m)獲得 m/z 581.431 7［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，根據(jù)文獻(xiàn)［19］推斷其分別為:兒茶精(catechin)、柚皮苷(tectoridin)．

峰14(圖2b)獲得m/z 611.243 0［M+H］+質(zhì)譜信號(hào)，根據(jù)文獻(xiàn)［20］推斷其為:異鼠李素(isorhamnetin)．

山楂籽中的黃酮成分液相保留時(shí)間、質(zhì)譜分子離子峰、分子量實(shí)驗(yàn)測(cè)定值和理論值如表2，通過(guò)比較可以看出分子量實(shí)驗(yàn)測(cè)定值和理論值相差很小，說(shuō)明推導(dǎo)結(jié)果的準(zhǔn)確可信．

表2 山楂籽提取液中黃酮的RRLC/Q-TOF MS分析Tab．2 RRLC/Q-TOF MS accurate mass measurements of flavones in extract of hawthorn seed

4 結(jié)論

本研究采用快速液相-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)山楂籽中的黃酮種類進(jìn)行快速的分析鑒定，建立了快速分析鑒定山楂籽中15種主要黃酮成分的方法．該方法具有操作簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、無(wú)需對(duì)照品、試劑消耗少、測(cè)定周期短等優(yōu)點(diǎn)，并為山楂植物中黃酮類化合物成分分析提供了一種新的有效、可靠的方法，對(duì)植物中有效成分的準(zhǔn)確分析鑒定具有重要的意義．

［1］劉榮華，邵峰，鄧雅瓊．山楂化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］．中藥材，2008，31(7):1100-1103．

［2］陳堅(jiān)，陳代鴻．山植果肉、核、葉中總黃酮的含量測(cè)定與比較［J］．基層中藥雜志，1999，13(4):8-9．

［3］文開(kāi)新，王成章，嚴(yán)學(xué)兵，等．黃酮類化合物生物學(xué)活性研究進(jìn)展［J］．草藥科學(xué)，2010，27(6):115-122．

［4］Peter C，Peter D，Marcel H．Estimation of daily human intake of food flavonoids［J］．Plant Food Hum Nutr，2007，62:93-98．

［5］陳勇，甄漢深，董藝．廣山楂及其葉質(zhì)量分析研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1999，10(7):511-512．

［6］孫立立，謝鴻霞，孫敬勇，等．比色法測(cè)定山楂中總黃酮的含量［J］．中成藥，2001，23(10):748-750．

［7］王福成，豆文太，朱文學(xué)．HPLC測(cè)定山楂精中牡荊素，牡荊苷-2″-O-鼠李糖苷．金絲桃苷．蘆丁的含量［J］．中成藥，2002，24(2):122-124．

［8］許紅蕾，周婷婷，范國(guó)榮．山楂葉化學(xué)成分的HPLCDAD/ESI-MS分析［J］．藥學(xué)實(shí)踐雜志，2009，27(1):40-42．

［9］鄭有飛，石春紅，汪本友．天然黃酮物質(zhì)提取技術(shù)和分析方法的研究進(jìn)展［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(1):102-107．

［10］李文龍，陳軍輝，殷月芬，等．加速溶劑提取-高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析蓮子心中生物堿［J］．分析化學(xué)，2008，36(1):79-82．

［11］韓超，陳軍輝，劉劼，等．高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜分析太子參中環(huán)肽類化合物［J］．分析化學(xué)，2006，34(12):1719-1722．

［12］葉茂，謝國(guó)祥，趙愛(ài)華，等．超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定苦參素注射液中苦參堿和氧化苦參堿［J］．中國(guó)中藥雜志，2008，33(12):1398-1401．

［13］何忠梅，孫佳明，張輝，等．固相萃取-高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法分析芍藥和酒芍藥的水溶性化學(xué)成分［J］．分析化學(xué)，2009，37(8):1201-1205．

［14］鄭振佳，王曉，王明林，等．固相萃取-快速分離液相-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析荷葉中的生物堿［J］．中草藥，2011，42(6):1066-1068．

［15］鄭振佳，初玉圣，遲炳海，等．快速分離液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析大豆中的異黃酮成分［J］．食品科學(xué)，2011，32(6):233-236．

［16］郭永學(xué)，李楠，楊美燕，等．山楂屬植物黃酮成分及其分析方法研究進(jìn)展［J］．中成藥，2005，27(1):112-115．

［17］Nikolov N，Seligmann O，Wagner H，et al．Neue Flavonoid-Glykoside and crataegus monogyna and Crataegus pentagyna［J］．Planta Med，1982，44(1):50-53．

［18］Dauguet J C，Bert M，Dolley J，et al．8-Methoxykaempferol 3-neohesperidoside and other flavonoids from bee pollen of Crataegusmonogyna［J］．Phytochemist，1993，33:1503-1505．

［19］劉霞，趙淑春，程宏，等．山楂黃酮類成分的分析測(cè)定［J］．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，19(3):50-52．

［20］袁冬梅，李一婧．山楂葉中黃酮含量的高效液相色譜法測(cè)定［J］．中國(guó)釀造，2007(12):66-68．

(責(zé)任編輯:李 寧)

Analysis of Flavonoids in Hawthorn Seed using Rapid Resolution Liquid Chromatography-Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer

PAN Guang-yan， ZHU Chuan-he， QIAO Ju-lin， ZHENG Zhen-jia
(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

In the paper，a novel method for flavonoids analysis in Hawthorn seed was investigated using rapid resolution liquid chromatography/quadrupole-time of flight mass spectrometer(RRLC/Q-TOF MS)．The flavonoids compounds from Hawthorn seed were extracted by ultrasound-assisted extraction technology and then separated using Welch Materials C18column(250 mm ×4.6 mm，5 μm)．Water containing 0.1%formic acid and acetonitrile was used as mobile phase．Time-of-flight mass spectrometer(TOF/MS)was applied for qualitative analysis under positive ion mode．Fifteen of the major flavones of hawthorn seed were identified．In conclusion，this method can be used to determine the flavones of Hawthorn seed rapidly．

RRLC/Q-TOF MS;hawthorn seed;flavone

TS207.3

A

1671-1513(2012)06-0052-05

2012-04-25

山東省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2009GG10009047);泰安市專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目．

潘廣彥，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué);

朱傳合，男，副教授，主要從事食品深加工及食品生物技術(shù)方面的研究．通訊作者．