周瑞，田呈瑞，*，高春燕，郝果，高亞妮，康宇新，孟友武

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2.山丹軍馬場食品公司，甘肅 山丹 734104）

黃參不同溶劑提取物抗氧化活性研究

周瑞1，田呈瑞1，*，高春燕1，郝果1，高亞妮1，康宇新1，孟友武2

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2.山丹軍馬場食品公司，甘肅 山丹 734104）

采用DPPH抗氧化、對羥基自由基致DNA氧化損傷保護(hù)的評價方法，研究了黃參正己烷提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物以及甲醇提取物的抗氧化活性的差異。結(jié)果表明，黃參不同溶劑提取物均對DPPH自由基具有很好的清除作用，并且能夠較好的保護(hù)DNA防止羥基自由基對其的損傷，但是不同溶劑提取物的抗氧化能力存在顯著差異；在不同溶劑的黃參提取物中，甲醇的提取率最高，但乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最強(qiáng)并且其總酚含量最高。在對DPPH自由基清除試驗中，溶劑提取物其總酚含量和抗氧化性的趨勢不一致，說明在黃參提取物中除酚類物質(zhì)外，還存在其它的抗氧化物質(zhì)。結(jié)合Folin-Ciocalteu、DPPH自由基清除率法和DNA損傷保護(hù)法分別測定黃參不同溶劑提取物中總酚的含量和抗氧化力，可初步評價黃參的抗氧化特性。

黃參；提取物；DPPH；DNA損傷

黃參[Sphallerocarpus gracilis（Bess.）K-Pol.]為傘形科（Umbelliferae）迷果芹屬的單種屬植物，生長在海拔1700 m～4000 m的高寒陰濕環(huán)境，廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、內(nèi)蒙古、甘肅、新疆以及青海等地，是多年生純天然草本植物[1]。黃參資源豐富，其通體金黃，根肉質(zhì)，且富含人體必需的多種營養(yǎng)元素，具有重要的藥用價值[2]。據(jù)《本草綱目》記載，黃參味甘、性溫，有補氣養(yǎng)血等功效，被譽為“小人參”[3-4]。黃參富含人體必需的多種氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素，是一種純天然保健食品。因此黃參是一種極具開發(fā)前景的藥食兼用的植物資源。但目前對黃參的研究甚少，為有效開發(fā)黃參資源，本文對黃參不同溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。本實驗采用Folin-Ciocalteu法測定黃參不同溶劑提取物中總酚的含量，并通過DPPH抗氧化、對DNA氧化損傷的保護(hù)的評價方法，比較了不同溶劑提取物清除DPPH自由基以及對DNA氧化損傷的保護(hù)的能力，為黃參作為天然抗氧化劑的研究開發(fā)提供了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃參：采于甘肅省山丹縣境內(nèi)。秋季成熟時采收，除去雜質(zhì)，將其根部陰干，磨碎，過40目篩，裝入保鮮袋密封貯于冰箱中備用。

Folin-Ciocalteu試劑沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH·）：Sigma公司；pBR322質(zhì)粒DNA：購于大連寶生生物公司；正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-10C型電腦三恒多用電泳儀：北京六一儀器廠；722-分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SN-D-2000超聲波直插式處理儀器：廣州市辛諾科超聲設(shè)備有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；電子分析天平：北京塞多利斯天平有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器：上海安亭實驗儀器有限公司；0.5 μL～1000 μL微量移液器：法國Gilson公司。

1.3 方法

1.3.1 黃參不同溶劑提取物的制備

準(zhǔn)確稱取5.0 g黃參置于三角瓶中，按固液比1:10（g/mL）加入正己烷，在超聲功率為160 W、時間30 min、室溫條件下，超聲提取3次，過濾，合并濾液并減壓蒸餾回收溶劑，得浸膏，稱重，用甲醇定容至10 mL，備用。采用同樣的方法，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇對濾渣進(jìn)行超聲提取，分別得到了黃參的正己烷提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇提取物[5-7]。

1.3.2 黃參不同溶劑提取物對DPPH自由基清除試驗

在試管中依次加入3.4 mL 50 μmol/L DPPH甲醇溶液和0.6 mL不同濃度的樣品提取液或甲醇，劇烈振蕩，保存于室溫黑暗中30 min，在517 nm處測定吸光值。試驗數(shù)據(jù)均為3管平均值，按下式計算DPPH自由基清除率。以樣品的加入量和DPPH清除率作圖，得到清除50%DPPH自由基所需要的黃參不同溶劑提取物的濃度，即 IC50值[8-9]。

1.3.3 黃參不同溶劑提取物對羥基自由基致DNA氧化損傷的保護(hù)試驗

在 0.25 mL的 PCR管中依次分別加入 1 μL pBR322 質(zhì)粒 DNA、10 μL 磷酸緩沖液（pH=7.4）、5 μL樣品提取液、2 μL 1mmol/L的FeSO4-EDTA溶液和2 μL 3%的H2O2溶液，充分混勻并于37℃水浴鍋中溫育30 min。反應(yīng)完后將該反應(yīng)物置于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，并用凝膠成像儀成像[10-12]。用磷酸緩沖液代替樣品提取液的管作為陽性對照，其余試劑和樣品管相同。

1.3.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取 0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 mL 濃度為200 μg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入100 μL濃度為1 mol/L的酚試劑，混勻后加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，并用蒸餾水定容至5 mL，搖勻室溫避光反應(yīng)40 min，于760 nm處測其吸光值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程A=0.1167C+0.0128，并求得相關(guān)系數(shù)r=0.9993。

1.3.5 黃參不同溶劑提取物中總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu方法測定[14-15]。按照上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法，用樣品提取液來代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，其余不變。黃參不同溶劑提取物中總酚含量以100 g提取物中含有相當(dāng)沒食子酸的毫克數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃參不同溶劑提取物中總酚的含量測定

黃參中的抗氧化成分主要是酚類化合物[16]，在不同溶劑中具有不同的溶解度，以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇為溶劑，采用超聲波處理依次對黃參進(jìn)行提取獲得相應(yīng)的提取物，并測定了不同溶劑提取物的提取率以及提取物中的總酚的含量，總酚定量以沒食子酸（GA）為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為每100克提取物中沒食子酸的毫克數(shù)。每個測定均重復(fù)3次，結(jié)果見表1。

表1 黃參不同溶劑的提取率及提取物中的總酚含量Table 1 Extract rates and total phenolic contents of S.gracilis extracts with different solvents

傳統(tǒng)的提取方法多為索氏提取等加熱方法，容易使其中的活性物質(zhì)發(fā)生變化，影響最后的效果，因此采用超聲波提取的方法，實現(xiàn)了常溫下充分提取并且盡可能保存了其中的活性物質(zhì)，取得了較好的提取效果。由表1可以看出，雖然黃參的乙酸乙酯提取物中的總酚的含量高于正己烷、二氯甲烷以及甲醇的提取物，但是黃參甲醇提取物的得率明顯高于其它幾種溶劑的提取得率。

2.2 黃參不同溶劑提取物對DPPH自由基清除作用

清除質(zhì)子自由基的能力是評價抗氧化物質(zhì)的抗氧化性的一種重要體系。DPPH在有機(jī)溶劑中很穩(wěn)定，是一種被廣泛應(yīng)用的自由基[16]。DPPH的有機(jī)溶劑呈紫紅色，在517 nm處有一個特征吸收峰，但是當(dāng)其遇到抗氧化劑時會褪色，吸光度變小。顏色越淡，吸光度越小，說明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)[17]。本試驗采用IC50值表示，提取物的IC50值越小，表示其抗氧化能力越強(qiáng)。黃參不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除效果見表2和圖1。

根據(jù)表2中不同溶劑黃參提取物清除DPPH自由基的IC50值可知：4種溶劑提取得到的黃參提取物對DPPH自由基均有一定的清除作用，如圖1所示，清除作用的強(qiáng)弱順序為：乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞正己烷提取物＞二氯甲烷提取物，用乙酸乙酯提取得到的提取物清除DPPH自由基效果最好。根據(jù)表1可知，不同溶劑提取物中總酚的含量由多到少排序為：乙酸乙酯提取物＞二氯甲烷提取物＞甲醇提取物＞正己烷提取物，此順序和對DPPH自由基的清除作用的強(qiáng)弱順序不完全一致，說明在提取物中除酚類物質(zhì)外，還有其它的具有抗氧化活性的物質(zhì)存在，有待進(jìn)一步研究。

表2 黃參不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力評價參數(shù)表Table 2 DPPH free radical scavenging activities of S.gracilis extracts with different solvents

續(xù)表2 黃參不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力評價參數(shù)表Continue table 2 DPPH free radical scavenging activities of S.gracilis extracts with different solvents

圖1 黃參不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力比較Fig.1 Comparison of the DPPH free radical scavenging activities of S.gracilis extracts with different solvents

2.3 黃參不同溶劑提取物對羥基自由基致DNA氧化損傷的保護(hù)作用

pBR322質(zhì)粒DNA是一種環(huán)狀負(fù)超螺旋DNA（SC），當(dāng)pBR322質(zhì)粒DNA受到損傷時，其分子中的1條鏈或者2條鏈會斷裂，于是形成帶切口環(huán)狀（OC）和線型DNA分子（Linear）。SC、OC和Linear這3種形態(tài)的分子因其分子質(zhì)量不同，所以其分子涌動的速度存在差異。在Fenton體系中pBR322質(zhì)粒DNA受到了羥基自由基的損傷，因其損傷程度不同，3種形態(tài)的分子所占的比例不相同，SC所占比例越低說明羥基自由基對質(zhì)粒DNA的損傷程度越大[18]。因此，對DNA損傷的保護(hù)程度可用來評價抗氧化劑的抗氧化性。圖2為黃參不同溶劑提取物對DNA氧化損傷的保護(hù)作用?？芍陔妶鲋杏縿铀俣扔煽斓铰捻樞蛞来螢椋篠C＞Linear＞OC。當(dāng)DNA受到羥基自由基的攻擊后，分子受到破壞，形成Linear和OC兩種分子形態(tài)，但是當(dāng)在反應(yīng)體系中加入黃參提取物后，DNA受到不同程度的保護(hù)。在提取物濃度相同的情況下,二氯甲烷提取物和乙酸乙酯提取物對羥基自由基致DNA氧化損傷的保護(hù)作用較強(qiáng)，正己烷和甲醇提取物之間的保護(hù)作用的強(qiáng)度較弱但差異都不顯著。根據(jù)試驗結(jié)果可以看出，黃參不同溶劑的提取物均對DNA的損傷有保護(hù)作用，其保護(hù)程度的強(qiáng)弱與提取物中總酚含量的多少基本相對應(yīng)，說明酚類物質(zhì)對DNA氧化損傷具有很好的保護(hù)作用。DNA可受化學(xué)物質(zhì)，輻射等多種傷害，可能引發(fā)疾病，對身體造成極大地?fù)p傷，因此對DNA的保護(hù)十分重要。

圖2 黃參不同溶劑提取物對DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of S.gracilis extracts with different solvents on hydroxyl radical mediated DNA degradation

3 結(jié)論

黃參的不同溶劑提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以很好的清除DPPH自由基，并且對羥基自由基致DNA氧化損傷具有較好的保護(hù)作用。不同溶劑提取物中總酚的含量由多到少的順序為：乙酸乙酯提取物＞二氯甲烷提取物＞甲醇提取物＞正己烷提取物；但是對DPPH自由基的清除作用的強(qiáng)弱順序為：乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞正己烷提取物＞二氯甲烷提取物，和總酚含量的趨勢不完全一致，說明在提取物中可能存在其它的抗氧化物質(zhì)對DPPH自由基具有清除作用；在對DNA損傷的保護(hù)試驗中，乙酸乙酯提取物和二氯甲烷提取物的保護(hù)作用明顯高于其余2種提取物的保護(hù)作用，基本和總酚含量的趨勢保持一致，說明酚類物質(zhì)對DNA的損傷具有較好的保護(hù)作用，但是也不排除其它影響DNA氧化損傷的物質(zhì)的存在，需要進(jìn)一步的研究。

總之，黃參各溶劑提取物均不失為良好的天然抗氧化劑，具有開發(fā)和利用的價值，如果對其粗提物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，從中可篩選出具有生物活性的單體化合物，將更具有研究價值和開發(fā)前景。

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Study on Antioxidant Activity of Different Solvents Extracts of Sphallerocarpus Gracilis

ZHOU Rui1,TIAN Cheng-rui1,*,GAO Chun-yan1,HAO Guo1,GAO Ya-ni1,KANG Yu-xin1,MENG You-wu2
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an 710062,Shaanxi,China;2.Shandan Junmachang Food Company,Shandan 734104,Gansu,China)

To examine the antioxidant activity of the different solvent extracts of Sphallerocarpus gracilis.Antioxidant activities of the samples were determined by two different test systems,DPPH and DNA oxidative damages induced by positioned and non-positioned hydroxyl free radicals assays.In all systems,the extracts exhibited different antioxidant activity in DPPH and DNA assays because of the different solvents.Ethyl acetate extract exhibited excellent activity potential than those of other extracts (hexane,dichloromethane and methanol).As expected,amount of total phenolics was very high in this extract,but others were different.No positive correlation was observed between the antioxidant activity potential and total phenolic level of the extract,so maybe there were other antioxidants in the extracts of the S.gracilis with different solvents.Uses of Folin-Ciocalteu,DPPH and DNA oxidative damages are important to determine the antioxidant activity of S.gracilis.

Sphallerocarpus gracilis;extracts;DPPH;DNA oxidative damage

周瑞（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：田呈瑞（1955—），男（漢），教授，學(xué)士，研究方向：食品科學(xué)。

2011-12-30