繆亞東

（紫瑯職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南通 226002）

灰樹花深層發(fā)酵富集鋅元素的研究

繆亞東

（紫瑯職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南通 226002）

灰樹花是藥食兩用真菌，富含多糖、氨基酸和礦物元素，可用液體深沉發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)。對鋅含量、馬鈴薯、葡萄糖、麩皮、接種量等對灰樹花的影響以及對灰樹花深沉發(fā)酵富集鋅元素的能力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，當(dāng)馬鈴薯含量為250 g/L，葡萄糖為30 g/L，麩皮為20 g/L，鋅含量50 mg/kg且接種量為20%時菌絲體生長較好。當(dāng)鋅含量大于1000 mg/kg時，菌絲體的生長受到抑制；當(dāng)鋅含量達(dá)到1500 mg/kg時，菌絲體生長極其緩慢?？傊?，鋅含量對菌絲體的生長影響顯著，其他因素對菌絲體生長的影響不大。另外，從灰樹花的富鋅能力來看，當(dāng)鋅含量為50 mg/kg～1500 mg/kg時，菌絲體的富鋅能力為124 mg/kg～2555 mg/kg。所以，綜合考慮生長情況和富集情況，選擇馬鈴薯為200 g/L，葡萄糖為24 g/L，麩皮為30 g/L，鋅含量為500 mg/kg，接種量為5%時，菌絲體的富鋅能力最好。

灰樹花；深沉發(fā)酵；富鋅能力；分光光度計

作為國際性健康食品，食用菌已經(jīng)越來越引起消費者的“食趣”，發(fā)達(dá)國家如此，國內(nèi)也是如此，這從近年食用菌的生產(chǎn)、消費以及出口情況即可得到證明。

灰樹花（Grifolafrondosa）又名貝葉多孔菌（polyporus frondosus），灰樹花是食、藥兼用蕈菌，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱非褶菌目多孔菌科樹花菌屬?；覙浠ǖ漠惷芏?，有些著作稱之為貝葉多孔菌，河北叫做栗子蘑、栗蘑，四川叫千佛菌，《福建通志》中稱為重菇，而當(dāng)?shù)厝罕姲阉凶錾徎ü?，北京市延慶縣東山地區(qū)稱之為甜瓜板，還有叫奇果菌或葉奇果菌的。由于我國較早的權(quán)威專著《中國的真菌》的采用，灰樹花便成為比較通用的漢語名稱?；覙浠ň哂兴赊臃枷?，肉質(zhì)柔嫩，味如雞絲，脆似玉蘭。據(jù)農(nóng)業(yè)部質(zhì)量檢測中心分析河北省遷西人工栽培的灰樹花，其營養(yǎng)和口味都勝過號稱菇中之王的香菇，能烹調(diào)成多種美味佳肴，是極其珍貴的高檔食用蕈菌[1-2]。

鋅是人體必需的重要微量元素，人體對鋅的需要量和含量與人體對鐵的需要量和含量一樣多。成人體內(nèi)約含有1.4 g～2.3 g鋅，分布在全身各部位和器官，其中皮膚約占20%，現(xiàn)已證明動物體內(nèi)80多種酶含有鋅。在人類飲食中缺乏足夠的鋅會對健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。在世界有些地區(qū)已發(fā)現(xiàn)由于鋅的缺乏而導(dǎo)致生長停滯，性成熟延緩，甚至引起侏儒癥的地區(qū)病。臨床上缺鋅引起的疾病有：皮炎，傷口愈合緩慢，免疫力降低，生長停滯，食欲不振和味覺異常等[3]。

不過食品中以游離態(tài)存在的鋅不易被人體吸收，且一般游離態(tài)的金屬均具有一定的毒性。因此，有機鋅（即結(jié)合鋅）則是一種理想的鋅源。本文對灰樹花液體深沉培養(yǎng)，在液體深沉培養(yǎng)基中加入了無機鋅鹽?；覙浠ㄓ酗@著的吸附作用并形成有機鋅。

1 儀器與材料

1.1 儀器

THZ-82B型恒溫振蕩器：江蘇金壇醫(yī)療儀器有限公司；L535-1型低速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；DHP-9052型微生物多用培養(yǎng)箱、MP502B電子天平：上海精密儀器有限公司；UV-2102PCS型分光光度計：尤尼柯分析儀器有限公司；LS-B50L高壓滅菌器：上海醫(yī)用核子儀器廠；SW-CJ-2FD無菌操作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；101-1型烘箱：上海榮豐儀器有限公司。

1.2 菌株

由中國農(nóng)科院菌種保藏中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

斜面固體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g/L，麥麩 50 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂粉 20 g/L，MgSO41.0 g/L，KH2PO43.0 g/L。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯250 g/L，麥麩25 g/L，葡萄糖 30 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCl20.1 g/L，VB10.1 g/L，VB2

0.04 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：與液體種子相同。

2 方法

2.1 母種斜面增殖培養(yǎng)

在無菌操作臺中，用已殺菌的接種環(huán)劃取少量的灰樹花母種菌絲體，接種于新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基中，用試管塞塞緊，然后放置于26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d～5 d。

圖2示，IRS-2蛋白表達(dá)陰性組與陽性組結(jié)直腸癌患者相比，陰性組患者4年P(guān)FS(HR=1.48，95%CI:0.766～2.856,P=0.243)，OS(HR=1.27，95%CI:0.548～2.941,P=0.578)雖然有優(yōu)勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。

2.2 液體種子培養(yǎng)基

在無菌操作臺中切取新鮮固體斜面菌一小塊（約0.8 cm2），然后接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，把搖瓶放置25℃、150 r/min環(huán)境下的搖床中培養(yǎng)至菌液清亮（出現(xiàn)稠密且大小均勻的菌絲球），大約4 d～5 d[4]。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌操作臺中，將液體種子培養(yǎng)基按不同的接種量接種于50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后再次把搖瓶放置25℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)至菌液清亮，大約需要7 d～8 d。

2.4 菌絲體生物量的測定

在轉(zhuǎn)速為3000 r/min的環(huán)境下，將發(fā)酵液離心20 min，水洗3次并且分別重復(fù)離心，倒出上層清液后，于60℃烘干24 h左右，稱干重。

2.5 培養(yǎng)基的配置方法

稱取300 g已經(jīng)切片的馬鈴薯放入水中，煮沸過濾后再加入36 g葡萄糖定容至500 mL后分別配置。

取出麥麩35g煮沸后過濾，把濾液定容至500mL，配置后分別加入到指定錐形瓶。

用電子天平分別稱出KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、CaCl20.1 g、VB10.1 g、VB20.04 g，然后用少量的蒸餾水稀釋，再分別均勻注入錐形瓶中，在溫度為121℃的環(huán)境下高壓滅菌30 min即可。

2.6 鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

從鋅的標(biāo)準(zhǔn)使用液中吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于250 mL的分液漏斗中，先加入蒸餾水，使其體積為10mL，再加入5mL2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 25%硫代硫酸鈉溶液，混合均勻，再加入30 mL 0.001%的雙硫酸使用液，振蕩3 min空白管調(diào)零，在520 nm波長下測定A得標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

2.7 樣品測定

菌絲體置于馬弗爐500℃烘干2 h左右，若不易燒白，取出后加硝酸消化，蒸干后再進(jìn)行灼燒2 h。取出樣品加入6 mol/L HCl 5 mL，用蒸餾水定容到100 mL，測定時取5 mL，加入5 mL蒸餾水再加入5 mL 2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 25%硫代硫酸鈉溶液，混合均勻，再加入30 mL 0.001%的雙硫酸使用液，振蕩3 min空白管調(diào)零，在520 nm波長下測定A。再通過A從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出鋅含量[6]。

2.8 計算方法

式中：M為由吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線查的鋅含量，（μg/g）；V 為樣品總體積，mL，本試驗為 100 mL；V1為測定用樣品總體積，mL，本試驗為5 mL；W為菌絲體干重，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗因素及水平的確定

采用馬鈴薯和葡萄糖組成的復(fù)合碳源，馬鈴薯為150 g/L～300 g/L，葡萄糖為 18 g/L～36 g/L，麩皮作為氮源，添加量在20 g/L～35 g/L內(nèi)變化。因素間的交互作用可以不考慮。ZnSO4·7H2O的添加范圍為50 mg/kg～1500 mg/kg。在前期研究的基礎(chǔ)上選用L16（45）正交表安排試驗，試驗因素和水平見表1。

表1 正交設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal desion

3.2 正交試驗數(shù)據(jù)及試驗結(jié)果

3.2.1 試驗數(shù)據(jù)

試驗數(shù)據(jù)，見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

3.2.2 菌絲體干重分析

以菌絲干重為指標(biāo)對數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析和方差分析，結(jié)果見表3和表4。

表3 極差分析表Table 3 Range analysis

3.2.3 富鋅能力分析

以富鋅能力為指標(biāo)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表5。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

表5 極差分析表Table 5 Range analysis

4 結(jié)論

1）鋅含量對菌絲體的生長影響顯著，當(dāng)鋅含量大于1000 mg/kg時，菌絲體的生長受到抑制；當(dāng)鋅含量達(dá)到1500 mg/kg時，菌絲體生長極其緩慢，基本上停止生長。可以看出生長的最佳條件是：馬鈴薯含量為250g/L；葡萄糖為30g/L；麩皮為20g/L；鋅含量50mg/kg；接種量為20%。

2）當(dāng)鋅含量為50 mg/kg～1500 mg/kg時，菌絲體的富鋅能力為124 mg/kg～2555 mg/kg。因為當(dāng)鋅含量超過1000 mg/kg時，菌絲體生長不好。

所以，綜合考慮菌絲體的生長情況和富集情況，可以看出最好的富集條件是：馬鈴薯為200 g/L；葡萄糖為24 g/L；麩皮為30 g/L；鋅含量為500 mg/kg；接種量為5%。

[1]徐潔,陳體強,朱培根,等.灰樹花浸膏粉的生產(chǎn)及化學(xué)成分分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,22(3):428-430

[2]汪維云.灰樹花液體深層培養(yǎng)及微量元素富集作用研究[D].江蘇理工大學(xué)博士論文,1999:1-2

[3]樊德金,陳九武,張素林,等.靈芝富鋅特性研究[J].湖北民族學(xué)院:自然科學(xué)版,1999,17(3):18-20

[4]劉偉民,黃達(dá)明,陳庶來,等.灰樹花液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].食品科學(xué),2003,24(3):99

[5]苗鳳琴,于世林.分析化學(xué)實驗[M].2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:77

[6]李京東,余奇飛,劉麗紅.食品分析與檢驗技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011:102

Study on Zinc Accumulation of Grifola frondosa with Submerged Culture

MIAO Ya-dong
（Zilang Vocational College,Nantong 226002，Jiangsu，China）

Containing rich polysaccharides,aimno acids and mineral element,Grifola frandosa which may be produced by submerged fermentation inlarger scale was edible-medicineal fungi.By analyzing effects on submerged fermentation of potato,glucose,zink and so on,factors and levels were obtained.And the Zn-resisting and Zn-accumulating characters of submerged culture Grifola frondsa were studied as follows:potato 250 g/L,glucose 30 g/L,wheat bran 20 g/L,zinc 50 mg/kg,seed volume 20%.However,the zinc content above 1000 mg/kg hampered its growth.When the zinc content is 1500 mg/kg,the Grifondsa frondsa grew much slowly.Another factors have little effect.When the zinc added to the liquid medium is in the range from 50 mg/kg-1500 mg/kg.The Zn-accumulation of Grifola frondosa is 124 mg/kg-2555 mg/kg.The results showed the best Znaccumulating character was potato 200 g/L,glucose 24 g/L,wheat bran 30 g/L,zinc 500 mg/kg,seed volume 5%.

Grifolafrondosa;submerged culture;Zn-accumulation;spectrophto-graphy

繆亞東（1980—），男（漢），講師，碩士，主要從事生藥與食品活性部位提取純化及藥理活性研究。

2011-12-18