謝榮俊 張樹友 李峰 周筱筠 劉龍飛 盧先州

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常見的外科急腹癥，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。最近發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡與AP的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，使之成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Bax是廣受關(guān)注的凋亡相關(guān)基因，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Bax與AP時(shí)腺泡細(xì)胞凋亡的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討AP時(shí)腺泡細(xì)胞凋亡與Bax表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SD大鼠30只(南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，雌雄不拘，體重(280±20)g，購(gòu)回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。抽簽法隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)，急性水腫性胰腺炎組(B組)，急性出血壞死性胰腺炎組(C組)，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 牛磺膽酸鈉(北京豐特斯化工材料有限公司)；淀粉酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；DNA原位末端標(biāo)記凋亡檢測(cè)試劑盒，Bax兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；微量泵(OLYMPUS公司)；創(chuàng)面封閉膠(廣州香雪生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型制備 對(duì)逆行胰膽管穿刺注射法加以改進(jìn)[1]：術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉滿意后固定于手術(shù)臺(tái)，術(shù)野備皮，絡(luò)合碘消毒，鋪無(wú)菌孔巾。取上腹部正中切口進(jìn)腹。顯露、提取十二指腸，辨認(rèn)胰膽管及肝門部膽總管。順胰膽管走行觀察乳頭開口位置，在其開口略偏下的系膜緣腸壁上選取一無(wú)血管區(qū)，用5號(hào)注射器針頭戳一小孔，置入預(yù)先處理過的硬膜外導(dǎo)管(直徑0.8 mm)。導(dǎo)管前端貼系膜緣腸壁向乳頭開口方向緩慢滑行，探入胰膽管內(nèi)。將導(dǎo)管推進(jìn)5 mm后，于胰膽管末端外放置一木質(zhì)短棒(無(wú)菌棉簽棒自制)，用小圓針、1號(hào)線將胰膽管下段及其內(nèi)的硬膜外導(dǎo)管一并縫合，確認(rèn)導(dǎo)管通暢后，打結(jié)于木棒上，同法縫扎關(guān)閉肝門部膽總管。導(dǎo)管末端接輸液轉(zhuǎn)換器，用微量泵逆行泵入0.5%(B組)或5%(C組)的牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g，0.2 ml/min)。藥物泵入5 min后即可見胰膽管、主胰管擴(kuò)張，胰腺組織水腫、充血(見圖1)，C組改變較B組嚴(yán)重。維持10 min后剪線，移除木棒，退出導(dǎo)管，用創(chuàng)面封閉膠封閉穿刺孔。將十二指腸復(fù)位，分層關(guān)腹。A組進(jìn)腹后，僅翻動(dòng)十二指腸、胰腺，不穿刺注藥。三組大鼠關(guān)腹后均于大腿外側(cè)皮下補(bǔ)液(生理鹽水2 ml/100 g)，蘇醒后禁食，自由飲水。

1.4 標(biāo)本采集與觀測(cè)指標(biāo) 術(shù)后12 h再次剖腹。肉眼觀察胰腺大體病理改變，根據(jù)Hughes標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行評(píng)分。觀察腹水顏色，收集腹水并計(jì)量。抽取下腔靜脈血檢測(cè)血清淀粉酶活性。采血后切取胰腺組織，10%福爾馬林固定，制作石蠟標(biāo)本切片觀察。標(biāo)本采集后斷頸法處死大鼠。

圖1 注藥后5 min，胰膽管擴(kuò)張，胰腺水腫、充血

圖2 B組術(shù)后12 h胰腺輪廓較清楚，廣泛水腫，局部可見皂化斑

圖3 C組術(shù)后12 h胰腺輪廓消失，出血壞死嚴(yán)重，可見暗黑色壞死灶

圖4 C組術(shù)后12 h腸系膜處可見大量皂化斑

圖5 B組TUNEL法染色見大量腺泡細(xì)胞凋亡(400倍)

圖6 C組TUNEL法染色見少量腺泡細(xì)胞凋亡(400倍)

圖7 B組免疫組化染色Bax重度陽(yáng)性(400倍)

圖8 C組免疫組化染色Bax輕度陽(yáng)性(400倍)

1.4.1 HE染色與鏡下病理評(píng)分 切片后行HE染色，100倍鏡下觀察，根據(jù)Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[3]評(píng)分。

1.4.2 DNA原位末端標(biāo)記法(TUNEL法) 按試劑盒說(shuō)明操作，腺泡細(xì)胞胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.3 免疫組化SABC法 按試劑盒說(shuō)明操作，Bax染色的陽(yáng)性反應(yīng)為腺泡細(xì)胞的胞膜、胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的比例不同分為4級(jí)：陰性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%;輕度陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～25%;中度陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%;重度陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；等級(jí)資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清淀粉酶活性與腹水量見表1。

表1 三組大鼠術(shù)后12 h各觀測(cè)指標(biāo)比較

2.2 大體病理改變及評(píng)分 A組：胰腺正常，腹腔內(nèi)無(wú)腹水與皂化斑。B組：胰腺輪廓較清楚，廣泛水腫，偶見點(diǎn)狀出血，未見明顯壞死，腹腔內(nèi)有少、中量清亮腹水，可見點(diǎn)狀皂化斑(見圖2)。C組：胰腺輪廓消失，出血壞死嚴(yán)重，可見暗黑色壞死灶，腹腔內(nèi)有大量血性腹水，胰腺、胰周及腸系膜等處可見大量皂化斑(見圖3、圖4)。大體病理評(píng)分見表1，病變愈重，分值愈高。

2.3 鏡下病理改變及評(píng)分 A組：除部分腺泡細(xì)胞水腫外，基本正常。B組：腺泡細(xì)胞水腫明顯，無(wú)壞死，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，小葉間可見炎性滲出，葉間隙略增寬，偶見微血管破裂伴紅細(xì)胞溢出。C組：腺泡細(xì)胞腫脹明顯，呈片狀壞死，伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，其間充斥著大量炎性滲出，葉間隙明顯增寬，間質(zhì)內(nèi)微血管破裂，大量紅細(xì)胞溢出。鏡下病理評(píng)分見表1，病變愈重，分值愈高。

2.4 腺泡細(xì)胞凋亡情況與AI見表1，圖5、圖6。

2.5 腺泡細(xì)胞Bax的表達(dá)情況見表1，圖7、圖8。

2.6 腺泡細(xì)胞凋亡與胰腺病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示：B、C組中腺泡細(xì)胞AI與大體病理評(píng)分(B組：r=-0.761，P<0.05；C 組：r=-0.780，P<0.05)及鏡下病理評(píng)分 (B組：r=-0.763，P<0.05；C 組：r=-0.664，P<0.05)均呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

臨床上大多數(shù)AP患者病因明確(膽石或酒精因素)，但相同的致病因素作用于不同個(gè)體時(shí)，胰腺病變的嚴(yán)重程度以及臨床表現(xiàn)和預(yù)后卻不盡相同隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們從細(xì)胞水平對(duì)AP進(jìn)行了詳盡的研究[4-7]，結(jié)果表明，AP發(fā)生時(shí)，最早的病理變化出現(xiàn)在胰腺的腺泡細(xì)胞內(nèi)，腺泡細(xì)胞本身對(duì)損傷的反應(yīng)，即細(xì)胞的死亡方式(壞死或凋亡)，是決定病變嚴(yán)重程度以及后續(xù)病理過程發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。如果腺泡細(xì)胞以壞死的方式死亡，將伴隨劇烈的炎癥反應(yīng)，易產(chǎn)生瀑布樣級(jí)聯(lián)效應(yīng)，使病情兇險(xiǎn)，并向重型發(fā)展；但若以凋亡的方式死亡，則伴隨的炎癥反應(yīng)輕微，病情向輕型發(fā)展。

筆者成功建立了大鼠急性水腫性與出血壞死性胰腺炎模型，發(fā)現(xiàn)B、C組在血清淀粉酶活性、腹水量、大體以及鏡下病理評(píng)分等方面均存在顯著性差異。采用TUNEL法檢測(cè)腺泡細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn)，B組AI顯著高于C組，直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩組AI與大體及鏡下病理評(píng)分等反映胰腺病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，AI高者，胰腺病變較輕，反之則較重。因此筆者認(rèn)為，AP時(shí)腺泡細(xì)胞的凋亡是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。

Bax作為Bcl-2家族成員之一[8]，主要通過改變線粒體外膜的通透性，調(diào)節(jié)促凋亡因子的釋放來(lái)調(diào)控細(xì)胞的凋亡[9]。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C組Bax的陽(yáng)性率顯著低于B組，兩組間Bax的表達(dá)以及腺泡細(xì)胞AI均存在顯著差異。據(jù)此推測(cè)，兩組大鼠在血清淀粉酶活性、腹水量、大體及鏡下病理評(píng)分之間的區(qū)別可能是由于組間Bax的差異性表達(dá)導(dǎo)致腺泡細(xì)胞的凋亡不等所致，提示Bax參與了AP時(shí)腺泡細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

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