馬慧群，閆小寧，張彩晴，袁景奕

（1.西安交通大學(xué)西北醫(yī)院，西安710003；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710003；3.解放軍323醫(yī)院，西安710068）

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic scleroderma,SSc）發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)是纖維細(xì)胞（fibroblasts,FB）膠原合成異常增多，而多種細(xì)胞因子對皮膚FB的膠原代謝具有顯著的調(diào)節(jié)作用[1]，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF）的作用最為重要。本研究通過陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000基因轉(zhuǎn)染的方法，構(gòu)建CTGF、TGF-β1真核表達(dá)載體，并觀察轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖變化以及凋亡情況，探討CTGF、TGF-β1對SSc和正常皮膚FB的影響,為進(jìn)一步研究CTGF、TGF-β1在SSc發(fā)病機制中的作用及干預(yù)策略奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 LipofectamineTM2000試劑盒與RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM誖I低血清培養(yǎng)基購自美國Gibco ERL公司；CTGF、TGF-β1質(zhì)粒由遠(yuǎn)泰公司設(shè)計并合成，0.25%胰蛋白酶購自美國Amersca公司；Annexin VFITC&PI凋亡檢測試劑盒購自美國ADL公司；碘化丙錠、RNA酶購自晶美生物公司；10%胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 SSc患者皮損及正常對照取材情況 6例病程<3年的進(jìn)展期SSc患者 (符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1980年分類標(biāo)準(zhǔn))，分別在局麻下切取上臂逐漸擴大的硬化皮損邊緣的皮膚組織。8例正常對照者皮膚取自整形外科手術(shù)者，兩組取材患者的性別、年齡及部位基本匹配，入選者均知情同意。

1.2.2 成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將組織剪成1～3 mm2左右的組織塊。用PBS緩沖液清洗組織塊3次；將組織塊按照一定間距轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)。輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，將適量培養(yǎng)液加到非細(xì)胞生長面上，注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞置37℃溫箱培養(yǎng)2 h左右，使小塊微干涸。從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出量增后，再補加培養(yǎng)液細(xì)胞，分離細(xì)胞。將分離出的細(xì)胞使用10%新生胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37℃下置于5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至80%，用0.25%胰酶消化傳代后接種（細(xì)胞密度5×104）于培養(yǎng)瓶或孔板，待細(xì)胞融合至約70%后分組為正常FC組、硬皮病FC組CTGF FC組、TGF-β1 FC組用于實驗。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.3.1 LipofectamineTM2000復(fù)合物的準(zhǔn)備 以250 uL Opti-MEM誖 Ⅰ稀釋 10 μL LipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育。250μL Opti-MEM誖 I稀釋4 μg DNA質(zhì)粒，混勻。混合稀釋的DNA質(zhì)粒和稀釋的LipofectamineTM2000，在室溫下孵育。

1.2.3.2 DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒。于轉(zhuǎn)染前一天，4～5×104細(xì)胞接種在6孔板上，2 mL含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將CTGF、TGF-β1 DNA 質(zhì)粒 LipofectamineTM2000復(fù)合物各自加入到對應(yīng)的每一個包含成纖維細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，48 h后進(jìn)行熒光檢測轉(zhuǎn)染率。熒光顯微鏡下，隨機選擇10個視野，分別計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，估算轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染率=（綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）。每組實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察 用細(xì)胞爬片法,將無菌蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板中,每孔加入1.0×104/mL細(xì)胞，待細(xì)胞爬片面積超過70%時,棄培養(yǎng)液,加入各組實驗血清，每組設(shè) 3個復(fù)孔；48 h后，按Hoechst33258試劑盒說明書進(jìn)行染色，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.2.5 細(xì)胞的凋亡檢測 使用Annexin V-FITC&PI凋亡檢測試劑盒檢測FB凋亡情況：在室溫下，以300×g離心 5～10 min，收集細(xì)胞。預(yù)冷 1×PBS（4 ℃）50 μL 重懸細(xì)胞 1 次，300×g離心 5～10 min，洗滌細(xì)胞。用事先配好的標(biāo)記液輕輕重懸細(xì)胞，105～106細(xì)胞/100 μL孵育液，在暗處，室溫下孵育15 min，再在每份標(biāo)本中加入10 μL PI。每100 μL孵育液中加入冷的Binding Buffer稀釋，15 min內(nèi)進(jìn)行流式檢測。流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞，計算凋亡率。每組實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件。實驗結(jié)果用（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用率或比表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 正常成纖維細(xì)胞原代接種培養(yǎng)24 h內(nèi)倒置顯微鏡下即可見胞核為多突的紡錘形或星形的扁平細(xì)胞，細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，位于細(xì)胞中央呈放射狀或柵欄狀排列，見圖1。

2.2 熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白CTGF和TGF-β1轉(zhuǎn)染硬皮病組成纖維細(xì)胞的效果 與正常組基因轉(zhuǎn)染相比，成纖維細(xì)胞明顯增多，形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞突消失。攜帶綠色熒光蛋白CTGF、TGF-β1基因的硬皮病成纖維細(xì)胞中綠色熒光蛋白基因表達(dá)的產(chǎn)物更明顯，大部分呈團塊狀，多數(shù)細(xì)胞核重疊，見圖2。CTGF、TGF-β1 基因轉(zhuǎn)染率為分別為，（85.7±2.1）%，（66.9±3.3）%，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示 CTGF、TGF-β1在硬皮病成纖維細(xì)胞中成功表達(dá)，且CTGF組轉(zhuǎn)染率明顯高于TGF-β1組，見表1。

表1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 （±s）

表1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 （±s）

注：*P＜0.05，與正常組比較。

組別正常組FB TGF-β1轉(zhuǎn)染硬皮病FB CTGF轉(zhuǎn)染硬皮病FB細(xì)胞總數(shù)（1×105）203.69±31.43 133.50±19.85 112.83±14.03轉(zhuǎn)染率（%）66.9±3.3*85.7±2.1*

2.3 流式結(jié)果 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：作用48 h后，各組均可見大量細(xì)胞為正常成纖維細(xì)胞，呈亮綠色熒光，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，小部分核染色質(zhì)和呈固縮或圓柱狀，細(xì)胞形態(tài)改變或細(xì)胞核聚集、邊緣化、核碎裂等典型細(xì)胞凋亡形態(tài)。凋亡率分析：相比正常組，其他各組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率均降低，其中以硬皮病轉(zhuǎn)染組凋亡率最低凋亡率降低（χ2=7.927，χ2=7.85，P<0.05），TGF-β1 和 CTGF 轉(zhuǎn)染硬皮病組FB細(xì)胞凋亡率明顯降低（χ2=9.33，χ2=9.84，P<0.01），見表 2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率 （±s）

表2 各組細(xì)胞凋亡率 （±s）

注：與正常組FC相比，硬皮病組及TGF-β1和CTGF轉(zhuǎn)染正常FC細(xì)胞凋亡率降低（χ2=7.927，χ2=7.85，P<0.05），TGF-β1 和 CTGF 轉(zhuǎn)染硬皮病組 FC 細(xì)胞凋亡率明顯降低（χ2=9.33，χ2=9.84，P<0.01）。

組別正常組FC硬皮病組FC TGF-β1轉(zhuǎn)染正常FC CTGF轉(zhuǎn)染正常FC TGF-β1轉(zhuǎn)染硬皮病FC CTGF轉(zhuǎn)染硬皮病FC細(xì)胞總數(shù)（1×105）233.85±18.41 136.00±5.22 186.83±4.93 118.17±21.16 129.33±7.75 122.17±5.75細(xì)胞凋亡率6.52%4.33%*4.25%*3.55%3.33%2.79%

3 討論

系統(tǒng)性硬皮病（SSc）的主要特點是成纖維細(xì)胞合成膠原增多，分解減少，大量膠原纖維在皮膚、肺、消化道等組織器官中沉積，組織器官纖維硬化，出現(xiàn)功能障礙。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是重要的促纖維化細(xì)胞因子之一，在SSc中有廣泛的細(xì)胞活性,可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白等ECM的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，并直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生[3-5]。CTGF是TGF-β重要的下游因子之一，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷徙，能促使Ⅰ、Ⅲ型膠原、FN等合成及產(chǎn)生ECM基質(zhì)，促進(jìn)纖維化的進(jìn)程，在皮膚和內(nèi)臟的纖維化進(jìn)展中起重要作用[6-8]。我們前期大量的工作研究發(fā)現(xiàn)CTGF蛋白Ⅰ型膠原和基因在正常小鼠中不表達(dá)或很少表達(dá)，在硬皮病小鼠模型中有表達(dá)[9]，表達(dá)量隨皮膚和肺組織纖維化程度不同而不同。結(jié)締組織生長因子在正常成纖維細(xì)胞中很少表達(dá)，而在TGF-β的誘導(dǎo)下能高度表達(dá)[10]。

脂質(zhì)體作為技術(shù)較為成熟的非病毒載體可作為有效替代物。脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染是通過脂質(zhì)體DNA復(fù)合物與細(xì)胞融合將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，具有高效、簡便、對細(xì)胞損傷小和容易重復(fù)等優(yōu)點[11]。Invitrogen公司的LipofectamineTM2000已被成功用于多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中，不但可用于DNA的轉(zhuǎn)染，還可用于siRNA，miRNA等小分子核苷酸的轉(zhuǎn)染[12-13]。

本研究將外源性CTGF、TGF-β基因成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的正常成纖維細(xì)胞和硬皮病成纖維細(xì)胞，成功構(gòu)建了CTGF、TGF-β1真核表達(dá)載體，并觀察到基因表達(dá)產(chǎn)物對成纖維細(xì)胞凋亡的抑制作用。試驗中比較各組細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，硬皮病組、CTGF、TGF-β轉(zhuǎn)染正常成纖維細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率較正常組降低，說明在硬皮病的發(fā)病中成纖維細(xì)胞的凋亡受到抑制，同時表明轉(zhuǎn)化生長因子和結(jié)締組織生長因子在硬皮病的發(fā)病過程中起重要作用。CTGF、TGF-β1真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究CTGF、TGF-β1在SSc發(fā)病機制中的作用及干預(yù)策略奠定實驗基礎(chǔ)。研究中選用含綠色熒光蛋白做為報告基因，直觀地觀察在一定波長下激發(fā)的綠色熒光在活細(xì)胞中的表達(dá)，利用此載體具有可瞬時表達(dá)產(chǎn)物及所表達(dá)產(chǎn)物便于快速檢測的特點，可以盡早了解轉(zhuǎn)移基因的情況。

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