張淑紅，鄭揚(yáng)云，吳清平，徐曉可，張菊梅，郭偉鵬

（廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和動物腸道的正常菌群，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或其侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件致病菌引起腸道外感染，是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌，食物或水中大腸桿菌的檢出即意味著直接或間接的近期糞便污染。

在國內(nèi)外各種標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中，食品中大腸桿菌的分離通常采用麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB），并結(jié)合其他生化反應(yīng)如乳糖發(fā)酵情況、氧化酶試驗(yàn)、三糖鐵瓊脂（TSI）、靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵等進(jìn)行鑒定，檢測周期較長。

近年來，一些顯色培養(yǎng)基被逐步研發(fā)出來，用于大腸桿菌的快速分離和鑒定。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基省去了對菌株進(jìn)行純培養(yǎng)的步驟，直接根據(jù)菌落顏色就可以做出初步判斷，具有更高的敏感性和特異性，操作簡便快速，可大大節(jié)省人力和物力[1-3]。

廣東環(huán)凱HKM和法國科瑪嘉CHROMagar E是國內(nèi)外檢測機(jī)構(gòu)和食品企業(yè)應(yīng)用較多的兩種大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，為進(jìn)一步探討顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用價(jià)值，本研究隨機(jī)采集了廣州市區(qū)超市和集貿(mào)市場的100份食品樣品，通過分析食品中大腸桿菌的污染情況，比較了HKM和CHROMagar E顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用效果，為顯色培養(yǎng)基的開發(fā)和技術(shù)改進(jìn)提供基礎(chǔ)研究資料參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

100份食品分別采自廣州市區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場，包括肉制品19份（包括生鮮和冷凍豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉、臘肉等）、速凍食品12份（餃子、云吞）、乳制品14份（巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳、豆奶等）水產(chǎn)品16份（魚、蝦、貝類）、果蔬16份、熟食19份（涼拌菜、粉面和熟肉制品等）、食用菌4份。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

移液器100-1000 μL：北京吉爾森科技有限公司；生物安全柜AC2-4S1：廣州浩瀚儀器有限公司；全自動高壓滅菌鍋TOMYES-215：日本三洋公司；一次性接種環(huán)1 μL：恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082、恒溫水浴鍋DK80：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

CHROMagar E大腸桿菌顯色平板：由鄭州博賽生物技術(shù)研究所分裝；乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、HKM大腸桿菌顯色培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)；API 20E生化鑒定試劑條：法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。以上培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2 檢驗(yàn)方法

檢測方法參考GB/T4789.6-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》[4]，具體方法如下。

1.2.1 樣品處理

無菌條件下將樣品在徹底剪碎，混勻，以無菌操作取樣品25 g（mL）加入到含有225 mL滅菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min～2 min。

1.2.2 分離

參考大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行MPN計(jì)數(shù)[5]，按9管法將樣品處理液接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，（36±1）℃培養(yǎng)24 h后，取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管中的菌液劃線接種于HKM和CHROMagar E顯色培養(yǎng)基，于（36±1）℃培養(yǎng) 18 h～24 h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。每個(gè)平板上挑取2個(gè)～3個(gè)疑似菌落，劃線接種NA平板純化，（37±1）℃培養(yǎng)18 h，進(jìn)行鑒定。

1.2.3 鑒定

挑取純培養(yǎng)可疑菌落，進(jìn)行染色鏡檢和氧化酶試驗(yàn)，同時(shí)利用API 20E鑒定條進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPASS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)比較兩種大腸桿菌培養(yǎng)基陽性率的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種培養(yǎng)基大腸桿菌生長狀況

將樣品增菌液劃線接種顯色培養(yǎng)基18 h～24 h后，可以直接觀察到藍(lán)綠色菌落生長，如圖1所示。

圖1 兩種顯色平板上大腸桿菌生長情況Fig.1 The performance of E.coli on two chromogenic media

在HKM大腸桿菌顯色平板上，可疑大腸桿菌為圓形、光滑、邊緣整齊、直徑1 mm～2 mm的深藍(lán)色或藍(lán)色，在CHROM agar E大腸桿菌顯色平板上，可疑大腸桿菌呈現(xiàn)圓形、光滑、邊緣整齊、直徑1 mm～2 mm的藍(lán)色或綠色菌落，色澤均較HKM顯色平板稍淺。檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在雜菌抑制方面，CHROMagar E顯色培養(yǎng)基略好于HKM顯色培養(yǎng)基。

2.2 兩種培養(yǎng)基大腸桿菌檢出率比較

兩種培養(yǎng)基大腸桿菌檢出率結(jié)果見表1。

表1 兩種顯色培養(yǎng)基上大腸桿菌的檢出情況Table 1 The positive rate of E.coli on the two chromogenic media

本次試驗(yàn)共檢測蔬菜水果16份，HKM顯色培養(yǎng)基檢出大腸桿菌7份，陽性率43.8%，CHROMagar E顯色培養(yǎng)基檢出大腸桿菌6份，陽性率為37.5%，卡方檢驗(yàn)表明，兩者無顯著性差異（X2=0.13，P=0.719>0.05）；檢測肉制品19份，HKM顯色培養(yǎng)基檢出大腸桿菌17份，CHROMagar E顯色培養(yǎng)基檢出大腸桿菌17份，兩者陽性率吻合，無差異；其余樣品包括速凍食品、乳制品、水產(chǎn)品、熟食、食用菌等，兩種培養(yǎng)基檢出率吻合，檢驗(yàn)結(jié)果均無差異；統(tǒng)計(jì)100份樣品中，兩種顯色培養(yǎng)基大腸桿菌的檢出率分別為66%和65%，卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示二者沒有顯著差異（X2=0.22，P=0.882>0.05）。

2.3 兩種培養(yǎng)基配對試驗(yàn)結(jié)果比較

對兩種培養(yǎng)基上分離的疑似菌落進(jìn)行純化和API 20E鑒定，結(jié)果從兩種平板上分離到3種假陽性菌株，其中HKM平板分離到4株，CHROMagar E平板上分離到5株，菌株分離鑒定結(jié)果如表2。表明兩種顯色平板都存在一定的假陽性。

表2 兩種顯色平板上假陽性菌株的分離鑒定情況Table 2 False positive strains from the two chromogenic media

3 討論

顯色培養(yǎng)基最大的優(yōu)點(diǎn)是在分離培養(yǎng)的同時(shí)包括顯色鑒定，這一過程只需18 h～24 h，大大縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。這種基于酶的試驗(yàn)方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來，在臨床診斷及食品微生物檢驗(yàn)中顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢[6-13]。目前，許多顯色培養(yǎng)基已得到美國食品和藥物管理局（FDA）、國際官方分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）等官方的認(rèn)可，并逐步被引入到國內(nèi)外各種標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中，用于食源性致病菌的快速檢測。我國最新執(zhí)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中，已引入顯色培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基，將顯色培養(yǎng)基與前增菌和選擇性增菌等步驟相結(jié)合，可以顯著提高目標(biāo)菌的檢出率。

市場上現(xiàn)有的顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品中，法國科瑪嘉的系列顯色培養(yǎng)基是國內(nèi)外普遍認(rèn)可和廣泛應(yīng)用的產(chǎn)品，質(zhì)量穩(wěn)定，但價(jià)格相對較高。國內(nèi)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司近年來也推出了一系列的顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品。本試驗(yàn)中，我們隨機(jī)采集了廣州市區(qū)各類食品樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，比較了兩種大腸桿菌顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用效果?？傮w而言，兩種培養(yǎng)基的檢測效果基本相當(dāng)，將增菌液劃線接種顯色培養(yǎng)基18 h～24 h后，根據(jù)藍(lán)綠色菌落的有無就可初步判斷結(jié)果。大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基上都呈現(xiàn)藍(lán)色-綠色菌落，在HKM平板上，目標(biāo)菌的顏色稍濃于CHROMagar E顯色培養(yǎng)基，分析可能是培養(yǎng)基中加入了更高濃度的顯色底物，使菌落顯色更深；而在非目標(biāo)菌的抑制方面，CHROMagar E培養(yǎng)基的抑菌效果更好一些，雜菌生長相對較少。從陽性樣品的檢出情況來看，此次抽檢的100份食品樣品中，99份樣品的檢測結(jié)果吻合，1份樣品檢測結(jié)果有差異（生菜、樣品號54#），兩種培養(yǎng)基的檢出率經(jīng)卡方檢驗(yàn)沒有顯著性差異。54#樣品CHROMagar E檢測結(jié)果陰性而HKM檢測陽性，將HKM平板上分離的菌株采用API 20E條進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)為大腸桿菌（API數(shù)值編號：5444573，93.2%，good identification），即 CHRO Magar E培養(yǎng)基出現(xiàn)1份假陰性結(jié)果。CHROMagar E出現(xiàn)漏檢可能與培養(yǎng)基中加入的抑菌劑成分或者高濃度有關(guān)，通常情況下，為了提高樣品中目標(biāo)菌的檢出率，顯色培養(yǎng)基中會加入特定種類和濃度的抑菌劑，抑制其他雜菌的生長，盡管抑菌劑可以起到抑制雜菌的目的，但是某些情況下也會對目標(biāo)菌生長造成一定影響，特別是當(dāng)樣品成分復(fù)雜、目標(biāo)菌活力較低、處于非可培養(yǎng)狀態(tài)時(shí)，高濃度的抑菌劑可能影響目標(biāo)菌的復(fù)蘇和檢出。

此外，在兩種平板上，除了檢出目標(biāo)菌外，都有假陽性菌株分離到。由于實(shí)際樣品中細(xì)菌種類繁多，不排除某些細(xì)菌會有與目標(biāo)菌同樣的酶，即某些非大腸桿菌的細(xì)菌也會存在大腸桿菌所具有的β-D-葡萄糖苷酶，在顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)與目標(biāo)菌同樣的顏色，因此可能會有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。對于假陽性的結(jié)果，需要檢驗(yàn)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來判斷。

顯色平板畢竟是基于生化特點(diǎn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，不可避免會出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。事實(shí)上，顯色培養(yǎng)基自推出和使用以來，其技術(shù)和配方也在不斷改良和優(yōu)化中。收集大量實(shí)際樣品和實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證是其中最常用的手段，一方面通過優(yōu)化基礎(chǔ)配方和顯色劑種類及濃度，使得目標(biāo)菌利于復(fù)蘇和生長，顯色清晰可辨；一方面，選擇更為高效的抑菌劑最大程度地減少非目標(biāo)菌的生長，逐步提高顯色培養(yǎng)基的特異性，最終目的使得檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，更能接近和真實(shí)反映樣品中致病菌的污染情況。

由于本實(shí)驗(yàn)所涉及的樣品種類和數(shù)量有限，實(shí)際樣品中可能還會出現(xiàn)各種各樣不可預(yù)知的情況，所以要評價(jià)大腸桿菌顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用效果，還需要大量樣本加以驗(yàn)證。另外，對于假陽性和假陰性結(jié)果，在實(shí)際應(yīng)用中，可盡量挑取較多的疑似菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)可平行使用多個(gè)平板，減少檢測果誤差，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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