朱佳,孫杰
(南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,江蘇 南京 210028)
VC又稱(chēng)作抗壞血酸,是維持機(jī)體正常生活活動(dòng)所需要的一類(lèi)小分子有機(jī)化合物,主要存在于新鮮蔬菜和水果及以其為原料的食品中。VC可促進(jìn)膠原蛋白抗體,具有抗癌的作用;它能參與神經(jīng)介質(zhì)、激素的生物合成;能將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸,使高膽固醇血癥患者的膽固醇下降;能將Fe3+還原為Fe2+,使其易于吸收,有利于血紅蛋白的形成。但人體自身不能合成VC,必須由食物中攝取。我國(guó)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 14880-1994)中,VC允許在水果、罐頭、果泥、飲料、硬糖、嬰幼兒食品等適量添加,各種強(qiáng)化和天然食品中的VC含量是食品檢測(cè)中的常規(guī)項(xiàng)目。因此,研究和掌握VC的性質(zhì),準(zhǔn)確測(cè)定VC的含量,對(duì)飲食健康、醫(yī)療保健都具有十分重要的意義。
現(xiàn)有的VC的檢測(cè)方法有很多,一般如光度分析法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)分析法等,如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中,GB/T 9695.29-1991《肉制品 維生素C含量測(cè)定》、GB/T 5413.18-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉維生素C的測(cè)定》、SN/T 0869-2000《進(jìn)出口飲料中維生素C的測(cè)定方法》,均采用熒光光度測(cè)定法;GB 7303-2006《飼料添加劑維生素C》和GB 14754-1993《食品添加劑維生素C》則采用碘量法,而GB/T 6195-1986《水果、蔬菜維生素C含量測(cè)定法》采用2,6-二氯靛酚滴定法。由于VC具有較強(qiáng)的還原性,在中性和堿性條件下不穩(wěn)定,遇熱容易破壞,上述方法一般具有試劑不穩(wěn)定,或操作步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn),在樣品處理過(guò)程中很容易使VC損失,因此在使用中有較大的局限性。
近幾年,維生素的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)得到重大的發(fā)展,特別是現(xiàn)代分析儀器與電腦技術(shù)的高度結(jié)合。高效液相色譜法HPLC是目前最常用的分析手段,能進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定,并可與其他分析技術(shù)聯(lián)用,需要的樣品量小,而且可配置不同的檢測(cè)器。近年來(lái),用高效液相色譜測(cè)定VC含量已經(jīng)有不少報(bào)道,但是實(shí)驗(yàn)的色譜條件有很大差異(見(jiàn)表1)。本文對(duì)近年來(lái)有關(guān)VC的測(cè)定方法進(jìn)行了比較,對(duì)色譜柱、浸提劑、流動(dòng)相、流動(dòng)相pH、流速、柱溫、檢測(cè)器等色譜測(cè)定條件進(jìn)行討論,探索更確切的測(cè)定方法。
反相色譜柱具有非常廣泛的應(yīng)用和較長(zhǎng)的使用壽命,近年來(lái)有關(guān)液相色譜測(cè)定VC的方法多數(shù)采用反相色譜柱。C18和C8都適用于水溶性和脂溶性維生素的測(cè)定。離子交換色譜也可以用于維生素的測(cè)定,但與反相色譜相比,壽命較短。陳忠明的文獻(xiàn)中指出,離子交換色譜柱易于不可逆地吸附某些樣品浸出液中的雜質(zhì),導(dǎo)致柱性下降且難以再生[1]。
表1 部分HPLC方法測(cè)定VC的條件Table 1 Determination of Vitamin C by high performance liquid chromatography
VC易溶于水,對(duì)熱、堿性、氧、光都很敏感,但在干燥或酸性條件下卻較穩(wěn)定,所以宜用酸性水溶液作為浸提劑[1]。偏磷酸是VC的最佳穩(wěn)定劑,且具有沉淀蛋白質(zhì)的作用[2]。但其價(jià)格較貴,在室溫下放置易轉(zhuǎn)化成正磷酸,降低對(duì)VC的穩(wěn)定性。草酸廉價(jià)易得,有與磷酸相近的穩(wěn)定性。但草酸對(duì)高蛋白質(zhì)樣品,可能有過(guò)濾困難。根據(jù)樣品類(lèi)型和色譜條件,也有用檸檬酸,醋酸等,對(duì)于飲料也有用蒸餾水直接稀釋的。
反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑,再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑,如甲醇、乙腈等。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。通常多用緩沖鹽體系作為測(cè)定水溶性維生素的流動(dòng)相。VC的出峰時(shí)間隨流動(dòng)相中極性調(diào)整劑含量的降低而保留時(shí)間逐漸延遲。對(duì)于基體復(fù)雜的樣品而言,保留時(shí)間的推遲有利于組分的分離。雍莉文獻(xiàn)報(bào)道采用甲醇-或乙腈-KH2PO4作流動(dòng)相測(cè)定飲料中VC,VC的保留時(shí)間短,對(duì)于組分較復(fù)雜的保健食品和果蔬樣品,VC的色譜峰往往不易與雜質(zhì)峰分離而干擾測(cè)定[3]。
由于VC極性強(qiáng),出峰早,易受早洗脫的雜質(zhì)干擾,因此多在流動(dòng)相中加入銨鹽作為離子對(duì)試劑以增進(jìn)保留。王愛(ài)月的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,流動(dòng)相中加入辛烷磺酸鈉,能夠抑制VC的離子化,改善峰形[4]。
也有試驗(yàn)報(bào)道,用醋酸、草酸的稀釋液作為流動(dòng)相,分離效果也比較好。胡志雄報(bào)道,采用2%醋酸溶液(pH 2.5)作流動(dòng)相,對(duì)抗壞血酸進(jìn)行反相色譜評(píng)價(jià),結(jié)果表明抗壞血酸有較適當(dāng)?shù)纳V保留時(shí)間和很高的柱效,峰形對(duì)稱(chēng)無(wú)拖尾[5]。王艷穎報(bào)道,用0.1%的草酸作為流動(dòng)相測(cè)定VC,相關(guān)系數(shù)為0.9993,線性關(guān)系較好,回收率達(dá)到97.4%~102.1%[6]。
控制流動(dòng)相的pH可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的電離,使其在色譜柱上有一定的保留,達(dá)到調(diào)節(jié)保留時(shí)間、控制分離度的目的。李連朝等報(bào)道,當(dāng)流動(dòng)相pH在2.0~3.0之間,VC峰的K較為理想,但為了使色譜柱有較長(zhǎng)的壽命,故不選pH為2.0,因?yàn)楫?dāng)pH接近2.0時(shí)鍵合成反相固定相的硅膠和烷基化合物之間形成的化學(xué)鍵被酸解;另一方面,隨著pH的增大,VC在流動(dòng)相中的穩(wěn)定性降低,而且VC峰的拖尾現(xiàn)象也愈來(lái)愈明顯[7]。
流速過(guò)低,分析時(shí)間長(zhǎng),流速過(guò)高,泵壓升高影響儀器壽命。通常流速選擇為1 mL/min。
雍麗等報(bào)道,改變柱溫從10℃~40℃,結(jié)果表明VC的保留時(shí)間隨溫度增高而降低,柱溫在20℃~30℃范圍內(nèi)VC的色譜峰面積最大[3]。
對(duì)VC的檢測(cè)可以使用紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器或電化學(xué)檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器花費(fèi)低,但只能通過(guò)保留時(shí)間確定,定性效果不好。二極管陣列檢測(cè)器,結(jié)合色譜的保留時(shí)間和光譜圖可以很好的對(duì)樣品進(jìn)行定性分析,分析峰純度。電化學(xué)檢測(cè)器靈敏度高。
與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中VC的熒光光度測(cè)定法相比較,邵麗華的研究結(jié)果表明,其研究建立的HPLC法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的熒光法相對(duì)比,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異無(wú)顯著性,說(shuō)明液相色譜的測(cè)定結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法一致[8]。
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