居正英，趙慧芳，吳文龍

（江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014）

黑莓（Blackberry）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）植物，原產(chǎn)北美[1]，是當(dāng)今風(fēng)靡歐美的第三代小果類果樹的重要成員。黑莓果實營養(yǎng)豐富，富含多酚類物質(zhì)和花色苷色素，具有較強的抗氧化[2]、清除自由基[3]、抗癌[4]、抗突變[5]、預(yù)防動脈硬化等作用。2000年以來黑莓的抗氧化作用逐漸成為研究的熱點[6]，而黑莓多酚物質(zhì)含量的測定可以較好的衡量黑莓果實的抗氧化能力。因此，建立快速準(zhǔn)確測定黑莓果實中多酚類物質(zhì)的方法，具有重要的意義。

目前總多酚含量的測定有紙層析、薄層層析、高效液相色譜、氣液色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、Folin-Ciocalteu試劑等多種方法[7-8]。其中紙層析、薄層層析在分離效果、速度和準(zhǔn)確定量方面存在缺陷；氣液色譜——質(zhì)譜聯(lián)用用于植物酚類物質(zhì)的分離測定速度快、靈敏度高，但該法需要衍生化處理，前處理比較麻煩；而高效液相色譜法費用較高，不適于大量的定量分析。比較而言，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法有價格低、操作方便等特點。為了建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確地測定黑莓果實中多酚含量的光譜分析方法，本實驗對Folin-Ciocalteu比色方法的主要影響因素及穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度等方面進行了研究，建立了測定黑莓總多酚含量的Folin-Ciocalteu法。為黑莓資源的高效開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Boysen品種黑莓凍果：2009年6月采于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所黑莓品種園，-18℃速凍保存。

1.2 試劑和儀器

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、Folin-Ciocalteu's試劑（2moL/L）、碳酸鈉、乙醇為分析純；EX-200A型電子天平：慈溪市天東衡器廠；HR2838PHILIPS攪拌機：飛利浦電子公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；PL-5-B型低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

取黑莓凍果400 g于微波爐中微波解凍，用攪拌機勻漿，備用。

1.3.2 總多酚的提取

稱取4.000 g黑莓勻漿，用120 mL 60%乙醇混勻，置于50 Hz，40℃超聲儀中超聲提取40 min，提取完成后，4000 r/min離心10 min，取上清液定容至200 mL，此樣品液備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.5000 g沒食子酸，用純凈水溶解，并定容至 1000 mL，分別移取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL 到 100 mL 容量瓶中，加水定容。其中沒食子酸的濃度分別為 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/L。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3.3.1方法配制各濃度的沒食子酸溶液，在0.5 mL各濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中加人2.5 mL 0.1 moL/L Folin-Ciocaltou試劑，然后加入2 mL 7.5%的Na2CO3，置于25℃下反應(yīng)120 min后在765 nm下測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 Folin-Ciocalteu法測定條件的優(yōu)化[9-10]

1.3.4.1 最佳波長的測定

取50 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及處理的樣品液各0.5mL中加入2.5mL 0.1moL/L Folin-Ciocaltou試劑，然后再加入2 mL 7.5%Na2CO3，25℃避光靜置120 min，用分光光度計在400 nm～900 nm波長范圍內(nèi)分別掃描沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與處理樣品液的吸收光譜，確定其最大吸收波長。

1.3.4.2 試劑濃度的優(yōu)化

Folin-Ciocaltou試劑濃度的確定：取4支10 mL具塞刻度試管，分別加入0.5 mL 50 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，然后分別加入0.08、0.1、0.12、0.2 mol/L的Folin-Ciocaltou試劑各2.5mL，混勻，最后依次加入2mL 7.5%的Na2CO3振蕩混勻，25℃避光反應(yīng)120 min后，于最大吸收波長處測定其吸光度，以吸光度最高的反應(yīng)體系的Folin-Ciocaltou試劑濃度為最優(yōu)濃度。

Na2CO3溶液濃度的確定：取4支10 mL具塞刻度試管，分別加入0.5 mL 50 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再分別加入2.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocaltou試劑后立即混勻，再分依次加入2 mL不同濃度5%、7.5%、10%、15%的Na2CO3溶液混勻，25℃避光反應(yīng)120 min后，于最大吸收波長處測定其吸光度，以吸光度最高的反應(yīng)體系的Na2CO3溶液濃度為最優(yōu)濃度。

1.3.4.3 顯色溫度與顯色時間的優(yōu)化

在10 mL具塞刻度試管中先加入0.5 mL 50 mg/L沒食子酸溶液，再加入2.5mL 0.1mol/L Folin-Ciocaltou試劑，然后加入2 mL 7.5%的Na2CO3振蕩混勻，分別在室溫（20℃）、25、30、40℃下，分別反應(yīng) 15、30、60、120、180 min后在765 nm下測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Folin-Ciocalteu法測定條件的優(yōu)化

采用Folin-Ciocaltou試劑法測定總多酚，其原理是酚酸類化合物分子上有極易氧化的羥基，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以將其氧化，自身被還原，在堿性條件下生成藍色化合物。顏色的深淺與酚酸含量呈正比，此反應(yīng)在一定條件下遵從Lambert-Beer定律，可測定酚酸總量[11-12]。

Na2CO3控制著反應(yīng)體系的酸堿環(huán)境及藍色物質(zhì)的生成，不同濃度的Na2CO3可能會影響體系的反應(yīng)顏色，因此有必要對反應(yīng)體系中Na2CO3的添加量進行研究。此外，對Folin-Ciocalteu法測定黑莓樣品液中多酚含量條件的優(yōu)化中，主要從影響顯色反應(yīng)的4個因素：顯色劑的用量、溶液的酸度、顯色溫度、顯色時間方面進行優(yōu)化。

2.1.1 最佳檢測波長的測定

按照1.3.4.1的方法測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與處理黑莓樣品液在400 nm～900 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描得圖1、圖2。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液加顯色劑顯色后全波長掃描譜Fig.1 The wavelength scanogram of Gallic acid after colorable reaction

圖2 黑莓樣品液加顯色劑顯色后全波長掃描圖Fig.2 The wavelength scanogram of blackberry sample after colorable reaction

由圖可知：沒食子酸對照品溶液和黑莓樣品溶液與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)顯色全波長掃描結(jié)果顯示在700 nm～770 nm之間均有明顯的吸收峰，因此采用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長765nm作為黑莓樣品液的最佳檢測波長。

2.1.2 試劑濃度的優(yōu)化

按照1.3.4.2方法對Folin-Ciocaltou試劑濃度進行優(yōu)化的試驗結(jié)果表明：顯色反應(yīng)2 h后各反應(yīng)液的吸光度隨著Folin-Ciocaltou濃度的不同存在差異，當(dāng)Folin-Ciocaltou濃度大于等于0.1 mol/L時吸光度為0.400左右，此時反應(yīng)體系的顯色反應(yīng)較充分且趨于穩(wěn)定，根據(jù)測定總多酚的原理可知，黑莓樣品液中的酚酸類化合物分子上有極易氧化的羥基已完全被氧化，生成藍色化合物。因此在利用Folin-Ciocalteu法測定黑莓樣品液時本著節(jié)約的原則選擇Folin-Ciocaltou試劑濃度為0.1 mol/L。

對在不同濃度Na2CO3溶液下進行反應(yīng)所測定的吸光度進行單因素方差分析結(jié)果表明：5%、7.5%Na2CO3的反應(yīng)體系中所測定的吸光度無明顯差異，然而10%、15%Na2CO3反應(yīng)系所測吸光度與5%、7.5%Na2CO3反應(yīng)體系所測的吸光度有明顯的差異且當(dāng)Na2CO3濃度為7.5%時可測得最大吸光度，說明7.5%Na2CO3可提供顯色反應(yīng)所需的最適pH，故選擇Na2CO37.5%作為最佳濃度。

通過不同F(xiàn)olin-Ciocaltou試劑濃度與不同Na2CO3溶液濃度的兩因素正交試驗結(jié)果分析可知：0.08 mol/L Folin-Ciocaltou試劑濃度與5%與7.5%碳酸鈉進行組合所測吸光度無顯著差異，但與10%、15%Na2CO3組合所測定的吸光度有顯著的差異。此外，0.1 mol/L Folin-Ciocaltou試劑與0.08 mol/L Folin-Ciocaltou試劑時與各濃度碳酸鈉之間的組合所測定的吸光度值無顯著的差異性，故從Folin-Ciocaltou試劑量的量取及實驗誤差角度考慮，最終選2.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocaltou試劑與2 mL 7.5%碳酸鈉為最佳組合，作為Folin-Ciocalteu法測定總多酚含量的試劑用量的選擇。

2.1.3 顯色溫度與顯色時間的優(yōu)化

按照1.3.4.3的方法對Folin-Ciocalteu法的顯色溫度與顯色時間優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同溫度下沒食子酸溶液加顯色劑后顯色不同時間所測定的吸光度Fig.3 The optical densities of the Gallic acid solution after colorable reaction in different temperatures and time

試驗結(jié)果表明，在不同的溫度下，多酚與顯色劑在45 min內(nèi)吸光度增大，顯色反應(yīng)迅速，反應(yīng)液的顏色變藍且藍色逐漸加深，在45 min以后吸光度的值趨于穩(wěn)定，且在隨后的4 h甚至更長時間保持穩(wěn)定。為保證反應(yīng)完全，將顯色反應(yīng)時間定為120 min，由圖3可知顯色反應(yīng)溫度對顯色效果也有一定的影響，在相對低溫的條件下，顯色反應(yīng)緩慢，吸光度小，但隨著溫度升高，多酚與顯色劑充分反應(yīng)所需的時間縮短，吸光度也有增加，但是反應(yīng)體系在40℃中并不能較長時間的保持穩(wěn)定性，隨著時間延長，反應(yīng)體系顏色變淺，吸光度下降。這表明生成的藍色物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定，容易分解褪色。此結(jié)果與何莎莉[13]的研究結(jié)果一致。此外由圖3可知，多酚與顯色劑在25℃下的反應(yīng)完成后穩(wěn)定性最好，從節(jié)約實驗室資源的角度考慮可將Folin-Ciocalteu法測定黑莓樣品液的溫度確定為25℃，避光反應(yīng)120 min在765 nm處測定吸光度，以計算黑莓樣品液中總多酚的含量。

2.2 Folin-Ciocaltou比色方法的評價

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3.3.2的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of gallic acid

由圖4可知，回歸方程為Y=0.0092X+0.004，相關(guān)系數(shù)R2為0.9993，結(jié)果表明：沒食子酸濃度在0～60 mg/L范圍內(nèi)與吸光度存在較好的線性關(guān)系。通過回歸方程、稀釋倍數(shù)及測得的吸光度可計算出樣品液的濃度，進一步計算出不同黑莓樣品中的多酚含量。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗

按照Folin-Ciocaltou法對黑莓樣品液中的顯色反應(yīng)進行穩(wěn)定性試驗，于25℃反應(yīng)分別放置0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7 h 隔時測定其吸光度分別為 0.104、0.106、0.107、0.107、0.110、0.110、0.113、0.114，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.352%，表明該方法在7 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.2.3 重復(fù)性試驗

按照Folin-Ciocaltou法對4份不同的黑莓樣品液的總多酚含量進行顯色反應(yīng)重現(xiàn)性，4份樣品液中所測得的黑莓果中總多酚的含量為2.699、2.676、2.690、2.677 mg/g，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.124%，說明該方法在測定黑莓處理液具有較好的重現(xiàn)性。

2.2.4 精密度實驗

按照Folin-Ciocaltou法對同一黑莓處理樣品液進行6次總多酚含量的測定，根據(jù)所測定的分光光度值計算樣品中總多酚的含量的結(jié)果為2.659、2.636、2.661、2.663、2.661、2.663 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 為1.051%，說明此方法具有很高的精密度，能夠達到樣品分析要求。

2.2.5 黑莓中多酚含量的測定

黑莓中多酚含量的測定如表1。

表1 黑莓中多酚含量的測定結(jié)果Table 1 The result about the content of polyphenol in blackberry

取黑莓凍果，按照方法1.3.1、1.3.2制備黑莓樣品溶液，將樣品溶液稀釋5倍后，按照1.3.4所述方法測定吸光度，按照下面的公式計算黑莓中多酚的含量：

TP（mg/g）=C×V/（1000×m）×100%

式中：V為黑莓樣品液的總體積；C是由吸光度根據(jù)回歸方程計算出稀釋后黑莓樣品液中的多酚的濃度，（mg/L）；m為稱取的黑莓勻漿4.000 g，由此，計算出黑莓果實中多酚的平均含量及RSD分別為2.646 mg/g,1.29%。

2.2.6 加樣回收試驗[14]

在黑莓的樣品液中分別加入不同量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定其總多酚的含量，并計算其回收率。

按照測定黑莓中多酚的方法進行測定黑莓樣品處理液的加標(biāo)回收試驗，由表可知，5次加標(biāo)回收試驗的最低回收率為98.5%，最高回收率為101.8%，平均回收率為100.2%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.40%。表明該方法準(zhǔn)確可靠，此法可用來對黑莓處理樣品液進行總多酚含量檢測。

表2 沒食子酸添加樣回收試驗結(jié)果Table 2 Result of gallic acid recovery experimentation in blackberry sample

3 結(jié)論

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對照品的Folin-Ciocalteu法測定黑莓果實多酚含量的最佳條件為：在5 mL的反應(yīng)體系中，加入0.5 mL樣品液，2.5 mL 0.1 mol/L的Folin-Ciocaltou試劑，2 mL 7.5%的Na2CO3溶液，顯色溫度25℃，反應(yīng)時間120 min，檢測波長為765 nm。在此條件下，沒食子酸濃度在0～60 mg/L范圍內(nèi)與吸光度存在較好的線性關(guān)系。

利用優(yōu)化后Folin-Ciocaltou方法測得Boysen品種黑莓凍果的總酚含量為2.646 mg/g（RSD為1.29%）。在加樣回收試驗中，沒食子酸的平均回收率為100.2%（RSD為1.40%）。

此總多酚含量的檢測方法具有操作過程簡單、便捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好、精密度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，建立的測定黑莓果實總多酚含量的Folin-Ciocalteu法的最佳條件，為測定黑莓果實總多酚含量的測定提供了可靠的方法，同時也為高效開發(fā)利用黑莓資源提供參考。

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