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        大豆蛋白凝膠顯微結(jié)構(gòu)研究

        2012-12-02 00:58:04于翠柳陳野李秀明郭立華張寧
        食品研究與開發(fā) 2012年9期
        關(guān)鍵詞:鹽鹵凝固劑戊二醛

        于翠柳,陳野,李秀明,郭立華,張寧

        (天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

        許多大豆食品的加工是利用大豆蛋白的凝膠化制作的,例如制作豆腐、酸乳酪等[1],大豆蛋白凝膠的形成與多種因素有關(guān),如大豆的化學(xué)性質(zhì)、豆?jié){中的固形物的含量[2]及凝固劑的濃度[3]等,許多科研人員研究了大豆蛋白凝膠的形成機理,李里特[4]等研究了豆腐的加工工藝以及鹽類凝固劑的凝固特性與作用機理,考察了基本的加工條件對豆腐凝膠強度的影響。大豆蛋白凝膠形成的實質(zhì)就是大豆蛋白在凝固劑的作用下相互結(jié)合,形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),將脂肪、水等成分包容在一起[5],這研究的是大豆蛋白凝膠的綜合特性。凝膠的形成有眾多的影響因素,為了減小脂肪、糖等成分對凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響,本實驗采用大豆分離蛋白作為原料來制備大豆蛋白凝膠,研究其凝膠形成特性。大豆蛋白凝膠的工藝以及工藝參數(shù)對凝膠質(zhì)構(gòu)影響的研究已經(jīng)很多,但這些條件對凝膠顯微結(jié)構(gòu)影響研究還不深入,本文采用鹽鹵、葡萄糖酸內(nèi)酯和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為凝固劑制備大豆蛋白凝膠,采用戊二醛和乙醇作為固定劑來固定凝膠的結(jié)構(gòu),冷凍干燥后測定其硬度并觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

        1 材料和方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        大豆分離蛋白:平頂山植物蛋白有限公司。

        鹽鹵:天津利民調(diào)料有限公司;葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL):江蘇康力生物科技發(fā)展有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase):江蘇一鳴生物制品有限公司;戊二醛:天津博迪化工股份有限公司;乙醇:天津市江天化工技術(shù)有限公司(均為分析純)。

        1.1.2 儀器

        KDM型調(diào)溫電熱套:A型,山東省鄄城永興儀器廠;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市金城國勝實驗儀器廠;MODULYOD-230型冷凍干燥機:美國熱電公司;TAXT plus型物性分析儀:北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司;SU1510型掃描電子顯微鏡:日本那珂事業(yè)所。

        1.2 方法

        1.2.1 大豆蛋白凝膠的制備

        配制質(zhì)量比為6%的生蛋白溶液,加熱至100℃并保持10 min,得到熟蛋白溶液。

        取300 mL熟蛋白溶液在500 mL的燒杯中,與不同濃度(質(zhì)量體積比分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)的鹽鹵混合3 min,將混合物迅速轉(zhuǎn)移到80℃的水浴鍋中保溫凝固30 min,制得鹽鹵處理的大豆蛋白凝膠,然后快速冷卻到20℃,最后儲放在4℃冷藏箱內(nèi)備用。

        另取30℃以下300 mL熟蛋白溶液在500 mL的燒杯中,與不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L)的葡萄糖酸內(nèi)酯混合3 min,其他的操作同鹽鹵,制得葡萄糖酸內(nèi)酯處理的大豆蛋白凝膠。

        取300 mL、50℃熟蛋白溶液倒入含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(10、20、30、40、50 kat/g)的燒杯中,將其置于 50 ℃的水浴鍋中3 h。制得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的大豆蛋白凝膠。

        1.2.2 大豆蛋白凝膠的固定和干燥

        大豆蛋白凝膠切成長條(65 mm×15 mm×15 mm),在一定濃度的固定劑溶液(不同濃度的戊二醛或100%乙醇)中固定24 h。用pH7.2的磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次10min。用體積分數(shù)分別為30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脫水,每種濃度的乙醇各處理10 min。經(jīng)脫水后,用冷凍干燥機進行干燥。

        1.2.3 掃描電鏡觀察

        干燥后的凝膠置于液氮中脆斷,處理好后粘在金屬樣品臺上,斷裂面向上,采用離子濺射方法鍍金,鍍金的條件為15 kV、15 mA、1.5 min。然后將樣品置于掃描電子顯微鏡(15 kV)下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

        1.2.4 大豆蛋白凝膠硬度測定

        冷凍干燥后的大豆蛋白凝膠放在物性分析儀上做硬度實驗,采用A/WEG探頭(30°角精細鍥型刀具),測試速度為2.0 mm/s,凝膠硬度是指探頭切斷凝膠時所受到的最大的力,儀器讀數(shù)單位為g。每種凝膠測定5次。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 處理方法對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

        2.1.1 凝固劑對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

        表1表示的是選取任意不同的凝固劑處理的凝膠樣品單位面積(1μm2)內(nèi)網(wǎng)孔的個數(shù)以及直徑。

        表1 不同的凝固劑處理下的凝膠網(wǎng)絡(luò)中網(wǎng)孔的個數(shù)及直徑Table 1 Number and diameter of holes in the gel network treated by different coagulants

        從表1可以看出,隨著鹽鹵的加入,網(wǎng)孔的個數(shù)增多,這是因為鹽鹵中的高價陽離子與大豆蛋白表面帶負電荷的氨基酸殘基結(jié)合,從而使蛋白質(zhì)間的靜電斥力減弱,當(dāng)大豆蛋白溶液中的鹽離子達到凝固濃度時,蛋白質(zhì)之間的斥力和引力達到平衡,蛋白質(zhì)結(jié)合成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);0.7%鹽鹵形成凝膠的網(wǎng)孔的個數(shù)最多,孔徑有減小趨勢,孔徑均等于或小于1μm,其原因為:隨著鹽鹵濃度的進一步增加,正離子對蛋白的靜電屏蔽作用增強,使得大豆蛋白分子之間的斥力進一步降低,引力增加,于是蛋白相互結(jié)合的速率加快,形成的網(wǎng)孔變多,孔徑略有減小。

        對于葡萄糖酸內(nèi)酯制備的凝膠樣品來說,隨著葡萄糖酸內(nèi)酯濃度的增加,網(wǎng)孔個數(shù)先增后減,0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯形成凝膠的孔的個數(shù)最多,孔徑呈減小趨勢,其原因為:當(dāng)加入葡萄糖酸內(nèi)酯后,葡萄糖酸內(nèi)酯逐漸水解產(chǎn)生H+,使蛋白質(zhì)分子所帶負電荷減小,分子間的靜電斥力減弱,當(dāng)葡萄糖酸內(nèi)酯的濃度達到一定程度時,在疏水相互作用等引力的作用下,蛋白分子逐漸結(jié)合到一起,形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。GDL濃度高于0.06 mol/L后,葡萄糖酸內(nèi)酯進一步水解產(chǎn)生H+,大豆蛋白分子電荷量繼續(xù)減小,分子間的結(jié)合力相對來說加強,蛋白分子相互結(jié)合的速率加快,容易堆扎在一起,孔的個數(shù)就會減少,孔徑也變小。

        此外,對于應(yīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備的凝膠樣品來說,TGase濃度是40 kat/g時,網(wǎng)孔的數(shù)量最多,孔徑最小。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase,簡稱TGase,全稱是蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶)是一種能夠催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間結(jié)合反應(yīng)的酶,蛋白或多肽之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物,其中蛋白質(zhì)(或多肽)交聯(lián)所產(chǎn)生的橋叫做ε-(γ-谷氨酰胺基)賴氨酸鍵(G-L鍵)[6]。Chanyongvorakul等[7]報道大豆蛋白在TGase的作用下,酸性亞基能夠交聯(lián)而被聚合。Sakamo[8]測定了TGase酶促反應(yīng)物ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸的含量,證明賴氨酸的含量隨著該酶濃度的升高而升高,這和本實驗中低酶濃度時的變化一致。TGase濃度升到50 kat/g時,凍干凝膠孔的個數(shù)迅速減少,孔徑也很小,說明維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定所需的共價鍵的數(shù)目具有一定的飽和性,過多的酶量反而不利于凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

        圖1是3種凝固劑處理的凝膠中網(wǎng)孔個數(shù)較多的凝膠樣品的SEM圖,圖1a是0.7%鹽鹵處理的凝膠的SEM圖,圖1b是0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的SEM圖,圖1c是40 kat/g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的凝膠的SEM圖。

        圖1 不同凝固劑處理的凝膠的顯微結(jié)構(gòu)(均由2.5%戊二醛固定)Fig.1 Microstructure of gels treated by different coagulants(all of gels were fixed by 2.5%glutaraldehyde)

        由圖1可見,采用2.5%戊二醛固定凝膠結(jié)構(gòu)的條件下,用3種凝固劑制備的大豆蛋白干凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有很大的差異:鹽鹵處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較粗疏、網(wǎng)孔大小不均且分布不均(圖1a),葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密程度高、網(wǎng)孔較小且均勻(圖1b),轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與葡萄糖酸內(nèi)酯處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相似,但其孔徑更?。▓D1b孔徑為 0.3μm,圖 1c孔徑為 0.1μm)。

        2.1.2 固定劑對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

        為了真實反映大豆蛋白凝膠的結(jié)構(gòu),采用固定劑固定其結(jié)構(gòu)。常用的固定劑有乙醇、冰醋酸、甲醛、戊二醛等,戊二醛是蛋白質(zhì)的強固定劑,但由于其毒性,故本實驗采用了100%乙醇作為固定劑,與戊二醛固定凝膠的結(jié)構(gòu)做對比,以觀察乙醇的固定效果。

        圖2是由0.7%鹽鹵制備的大豆蛋白凝膠的SEM圖。

        圖2 不同固定劑處理的凝膠的顯微結(jié)構(gòu)(凝固劑均為0.7%鹽鹵)Fig.2 Microstructure of gels treated by different fixatives(coagulant of gels was 0.7%brine)

        由圖2可見,2.5%和6%戊二醛的固定效果相似,由此判斷,不同濃度的戊二醛對凝膠的顯微結(jié)構(gòu)無顯著影響;100%乙醇同樣能夠起到很好的固定效果,乙醇是一種極性有機溶劑,羥基中的H帶正電,O帶負電,可分別與大豆蛋白分子中的相反電荷作用,降低蛋白質(zhì)分子間的無序凝聚,有利于形成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

        2.2 凝固劑和固定劑對凝膠硬度的影響

        凝膠強度是大豆蛋白凝膠的一個很重要的參數(shù),也反映出蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密程度,因此采用凝膠的硬度來反映其強度的大小。圖3是鹽鹵處理的凍干凝膠的硬度。

        圖3 鹽鹵和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.3 Effect of brine and fixatives on the hardness of the gel

        由圖3可見,同種固定劑固定的凝膠硬度隨著鹽鹵濃度的增加變化不大,不同的固定劑能對凝膠硬度產(chǎn)生顯著影響,100%乙醇固定的凝膠的硬度最大(約2500g),其次是6%戊二醛固定的凝膠硬度(約2000g),2.5%戊二醛固定的凝膠硬度最?。s1500 g)。100%乙醇固定的凝膠硬度最大,分析原因是:乙醇分子通過羥基OH和蛋白分子之間形成氫鍵,提高了大豆蛋白分子定向排列的有序性,因此用乙醇固定凝膠的硬度有顯著的提高。

        2.5%和6%的戊二醛對凍干后凝膠的硬度有顯著影響,故進一步對中間濃度3.5%、4.5%、5.5%戊二醛處理的葡萄糖酸內(nèi)酯凝膠的硬度進行檢測,觀察不同濃度的戊二醛處理的凝膠硬度是否有明顯區(qū)別。100%乙醇固定的葡萄糖酸內(nèi)酯凝膠凍干后碎成小塊,故無法進行硬度測定。

        圖4 葡萄糖酸內(nèi)酯和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.4 Effect of GDL and fixatives on the hardness of the gels

        由圖4可見,葡萄糖酸內(nèi)酯濃度對凝膠硬度的影響不大,而不同濃度的戊二醛能對凝膠硬度產(chǎn)生明顯的影響,硬度隨著戊二醛濃度的增加而增大,2.5%戊二醛固定的凝膠硬度最?。s1000 g),6%戊二醛處理的凝膠硬度最大(約3500 g)。

        凝膠的顯微結(jié)構(gòu)直接影響著其物理特性,大豆蛋白凝膠不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了強度的變化。網(wǎng)孔越致密,強度越高。由表1分析得知0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠具有最致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),0.1 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠有最少的網(wǎng)孔和最小的孔徑,因此0.1mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的硬度是最大的。

        圖5 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of TGase and fixatives on the hardness of the gels

        圖5是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的凝膠的硬度。隨著TGase酶量的增加,凍干凝膠的硬度逐漸增加,這說明形成的GL肽鍵在空間結(jié)構(gòu)上提高了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的機械性能,有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。6%戊二醛固定的凝膠硬度明顯高于2.5%戊二醛固定的凝膠硬度。

        3 結(jié)論

        通過對不同的凝固劑和固定劑作用下形成大豆蛋白凝膠顯微結(jié)構(gòu)和硬度的測試與觀察分析,結(jié)果表明:大豆蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要是由凝固劑決定的,由0.7%鹽鹵、0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯、40 kat/g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備的凝膠有較多的網(wǎng)孔個數(shù);大豆蛋白凝膠的硬度與凝固劑和固定劑的濃度有關(guān),其中固定劑對凝膠硬度的影響顯著,100%乙醇固定的凝膠的硬度最大,其次是6%戊二醛固定的凝膠的硬度。

        以上數(shù)據(jù)為大豆蛋白凝膠制備的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考,也為大豆蛋白凝膠在組織工程支架材料方面的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。另外,通過研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在凝膠形成中的作用機理,發(fā)現(xiàn)該酶適合于制備大豆蛋白凝膠,這將是大豆蛋白凝膠方面新的研究方向。

        [1]陳復(fù)生,李里特.大豆蛋白凝膠光學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2002:3

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