孫金旭

（衡水學院生命科學系，河北 衡水 053000）

覆盆子（raspberry）又稱樹莓、大號角公，薔薇科懸鉤子屬漿果植物。主產(chǎn)于浙江、福建、四川、陜西、安徽、江西、貴州等地。覆盆子果實富含氨基酸、礦質元素、有機酸和VE[1-2]人體必需的營養(yǎng)素外，還含有黃酮、多糖、粗三萜等功能性物質。

目前對于黃酮提取的方法主要有水煎煮法、乙醇提取法、加助溶劑提取法、超聲波法、超濾法、微波提取法、高速逆流色譜法、亞臨界水提法等多種方法[3]。各種方法各有優(yōu)缺點，該實驗對乙醇提取法進行了研究，采用單因素和響應面試驗，優(yōu)化了覆盆子黃酮提取的工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

覆盆子干果（一級品）：購于衡水市中醫(yī)院藥店，凈制粉碎過40目篩，50℃烘干備用。樣品成分分析中所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器

XFB-200粉碎機：湖南忠誠制藥機械廠；HH-6恒溫水浴鍋：上?？等A生化儀器廠；Uitrospec 3300 pro紫外可見分光光度計；美國GE公司。

2 方法

2.1 總黃酮含量的測定[4]

樣品液測定方法為：（1）準確量取待測液5.00 mL，其余操作同標準曲線繪制的測定方法，測定待測液吸光度。（2）準確量取待測液5.00 mL，加入蘆丁標準品溶液2.00 mL，其余操作同標準曲線繪制的測定方法，測定混合液的吸光度。（3）測定標準曲線見圖1。

由標準曲線可知蘆丁含量與吸光度存在良好的線性關系。 總黃酮濃度計算公式為：

式中：A為分光光度法測定覆盆子提取液吸光度值；C為覆盆子提取液黃酮濃度，（mg/mL）；B為覆盆子黃酮提取量，（mg/g）；V為覆盆子黃酮提取液總體積，mL；Z為覆盆子干果總質量，g。

2.2 各單因素對黃酮提取率的影響

選定不同濃度乙醇、提取時間、溫度等3個因素，主要以總黃酮提取率作為指標，進行單因素試驗考察。

2.3 響應面法優(yōu)化黃酮提取因素水平

響應面法優(yōu)化黃酮提取因素水平，見表1。

表1 響應面法黃酮提取因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface for flacone extracting

3 結果與討論

3.1 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

稱取覆盆子干果10 g分為6份，粉碎至粒度為（300μm～400μm），放入燒杯中，按 50%、60%、70%、80%、90%、100%的比例將乙醇分別加入1∶10的料液中，80℃下，提取6 h，測定黃酮濃度，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨乙醇濃度不斷增加，提取黃酮濃度不斷增大，當乙醇濃度為70%，黃酮濃度達到最大，為2.01 mg/g，之后隨乙醇濃度增加，黃酮濃度反而下降，因此，70%的乙醇濃度為最適覆盆子黃酮提取的濃度。

3.2 浸提溫度對黃酮提取量的影響

稱取覆盆子干果10 g，分為6份，粉碎至粒度為（300μm～400μm），放入燒杯中，料液比例為 1∶10，乙醇濃度70%，提取時間6 h，提取溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃，提取結束后測定黃酮濃度，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨浸提溫度不斷升高，黃酮提取濃度不斷增加，當浸提溫度為90℃時，黃酮浸提濃度達到最大為2.15 mg/g，之后黃酮浸提濃度有所下降，因此，90℃為黃酮浸提的最適溫度。

3.3 浸體時間對黃酮提取量的影響

稱取覆盆子干果10 g，分為6份，粉碎至粒度為（300μm～400μm），放入燒杯中，料液比例為 1∶10，乙醇濃度70%，提取溫度90℃，浸體時間分別為4、5、6、7、8、9 h，結果如圖 4 所示。

由圖4可知，隨提取時間的延長，黃酮提取濃度也依次增加，到8 h時，黃酮提取濃度達到最高，最高提取量為2.23 mg/mL，當高于8 h時，黃酮提取濃度下降，故8 h的提取時間為黃酮提取的最佳時間。

3.4 黃酮提取工藝優(yōu)化

3.4.1 覆盆子黃酮提取響應面數(shù)據(jù)方案及結果

根據(jù)單因素試驗結果，考慮到實驗的可操作性，將料液比例設定為1∶15，采用響應面分析法進行設計，對提取溫度、提取時間、乙醇濃度三因素三水平共15個試驗點（3個中心點）的響應面分析試驗，運用SAS軟件的 RSREG（Response surface regression）程序對15個試驗點的響應值進行回歸分析。以覆盆子干果黃酮提取濃度為響應值，經(jīng)回歸擬合后,確定函數(shù)表達式。試驗結果見表2。

表2 響應面數(shù)據(jù)方案及試驗結果Table 2 The data plan and result for response surface

3.4.2 模型的建立與顯著性檢驗

對回歸方程進行顯著性檢驗、方差分析及各因素最佳點值分析，采用SAS RSREG程序對表3數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，結果見表3。

表3 三因素三水平中心組和參數(shù)估計Table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

續(xù)表3 三因素三水平中心組和參數(shù)估計Continue table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

該方程回歸顯著，模型的復相關系數(shù)的平方即R2=97.64%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實實驗點進行分析。由表3中的 P 值可知道，方程中 X1、X2、X3、X1X1和 X3X3對 Y值的影響達顯著水平，表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的關系，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。交互項系數(shù)均不顯著，所以交互作用的影響相對較小。失擬項的p=0.2320，沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當。

用Design Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，選擇對響應值顯著的各項，可得提取乙醇濃度、提取時間、提取溫度與黃酮提取濃度之間的多項回歸方程，回歸方程為:

通過軟件分析，得到覆盆子黃酮提取量最大時X1=0.1173；X2=0.3927；X3=0.2663 計算得到最佳工藝條件為：乙醇濃度91%，提取溫度74℃、提取時間8.3 h。此條件下，黃酮提取量為2.54 mg/g。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進行提取試驗，實際測得的平均值為2.53 mg/g，與理論預測值相比，其相對誤差約為1%，因此，基于響應曲面法所得的覆盆子干果黃酮提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

4 結論

實驗證明響應面方法是優(yōu)化發(fā)酵條件非常有效的工具，Box-Behnken實驗設計能建立主要因素影響覆盆子黃酮提取的二次多項數(shù)學模型，并利用統(tǒng)計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優(yōu)化了內在因素水平，找出最佳值。本研究經(jīng)響應面方法優(yōu)化，得出產(chǎn)覆盆子黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度91%，提取溫度74℃、提取時間8.3 h。此條件下，方程預測值和驗證試驗值相差1%，覆盆子黃酮的最大提取量達到2.53 mg/g。

[1]汪傳佳.覆盆子資源開發(fā)利用研究綜述[J].浙江林業(yè)科技,2004,24(1):65-68

[2]李繼仁,何冰.覆盆子類22種生藥中微量元素的含量分析[J].微量元素與健康究,1999,16(3):29-31

[3]王梅芳,武堅銳.黃芩總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].基層醫(yī)學論壇,2006,10(3):967-972

[4]朱會霞,孫金旭,魏淑珍,等.覆盆子保健啤酒的研制[J].食品工業(yè)科技，2007,28(10):154-156