陳穎麗 張殿文 王清 李偉

長(zhǎng)春西汀注射液為腦血管擴(kuò)張藥，能抑制磷酸二酯酶活性，增加血管平滑肌松弛的信使c-GMP的作用，選擇性地增加腦血流量，此外還能抑制血小板凝集，降低人體血液粘度，增強(qiáng)紅細(xì)胞變形力，改善血液流動(dòng)性和微循環(huán)，促進(jìn)腦組織攝取葡萄糖，增加腦耗氧量，改善腦代謝。臨床上用于治療由于大腦血液循環(huán)障礙而引起的精神性或神經(jīng)性癥狀，改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動(dòng)脈硬化癥等誘發(fā)的各種癥狀。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)長(zhǎng)春富春制藥有限公司生產(chǎn)的長(zhǎng)春西汀注射液的溶血性、血管刺激性和過敏反應(yīng)做出評(píng)價(jià)，為其臨床用藥的安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物和試劑 長(zhǎng)春西汀注射液，規(guī)格為2 ml/支，5 mg/ml，由長(zhǎng)春富春制藥有限公司提供，批號(hào):20090801，每次臨用前用生理鹽水或5%葡萄糖溶液配制成適宜濃度備用。牛血清白蛋白，Genview產(chǎn)品，批號(hào):9AD105106，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。天花粉蛋白，由本院藥理室提供。伊文思藍(lán)，F(xiàn)laka進(jìn)口分裝，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠。甲醛溶液，沈陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠，批號(hào):081006。水合氯醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):T20080926。

1.2 動(dòng)物 ①Wistar種大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，合格證號(hào):(J)2008-0005。②白色豚鼠，體重200～250 g，雄性，合格證號(hào):(J)2008-0004。③家兔，體重2.5-3 kg，雌雄各半，合格證號(hào):(J)2008-0004。均購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶血試驗(yàn)［1-3］取10 ml潔凈試管21只，1～5號(hào)管為供試品管，6號(hào)管為陰性對(duì)照管，7號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管。按表1所示劑量依次加入2%兔紅細(xì)胞混懸液、生理鹽水或蒸餾水或供試品液體，各管輕輕搖勻后放入37℃恒溫水浴箱中孵育，觀察記錄0.25、0.5、0.75、1、2、3、4 h 溶血反應(yīng)結(jié)果。溶血評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:全溶血為溶液澄明紅色，管底無(wú)紅細(xì)胞殘留;部分溶血為溶液澄明紅色或棕色，管底有少量紅細(xì)胞殘留;不溶血為紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無(wú)色澄明;凝聚為雖不溶血，但出現(xiàn)紅細(xì)胞凝聚，振搖后不能分散。結(jié)果見表1。

由表1可見，長(zhǎng)春西汀注射液0.3 mg/ml(5倍臨床使用濃度)、溶媒及陰性對(duì)照管(生理鹽水)在4 h內(nèi)均未見澄明紅色，且紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無(wú)色澄明，經(jīng)振搖后紅細(xì)胞能均勻分散，未見溶血和凝聚現(xiàn)象。而陽(yáng)性對(duì)照管(蒸餾水)則產(chǎn)生明顯的溶血反應(yīng)。表明長(zhǎng)春西汀注射液在0.3 mg/ml以下濃度無(wú)溶血及無(wú)紅細(xì)胞凝聚作用。

2.2 全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)［1-3］實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物預(yù)先飼養(yǎng)1周以觀察其活動(dòng)表現(xiàn)，取96只健康雄性白色豚鼠，隨機(jī)分成六組，每組16只，第一組為生理鹽水組，第二組為5%葡萄糖組，第三組為溶媒組，第四組為陽(yáng)性對(duì)照組(牛血清白蛋白25 mg/kg)，第五、六組分別為長(zhǎng)春西汀(0.35 mg/ml或1.75 mg/ml)0.5 mg/kg、2.5 mg/kg。分別給各組豚鼠隔日腹腔注射一次，體積均為0.5 ml/只，共注射3次，使豚鼠致敏。然后將每組分成兩批，于第1次致敏后14 d及21 d各組分別耳靜脈注射生理鹽水、溶媒、牛血清白蛋白50 mg/kg、長(zhǎng)春西汀2 mg/kg、10 mg/kg，體積均為1 ml/只，進(jìn)行激發(fā)過敏反應(yīng)。觀察豚鼠在靜脈注射后30 min內(nèi)有無(wú)表4中的躁動(dòng)、抓鼻、豎毛、咳嗽、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等過敏反應(yīng)癥狀。并按全身主動(dòng)過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定過敏反應(yīng)級(jí)別。結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可見，生理鹽水組、5%葡萄糖組、溶媒組、長(zhǎng)春西汀注射液大、小劑量組，在靜脈給藥30 min內(nèi)，豚鼠活動(dòng)正常，未出現(xiàn)1～20級(jí)反應(yīng)癥狀，判定為過敏反應(yīng)陰性。而陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、抓鼻、豎毛、咳嗽、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等現(xiàn)象，判定為過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性。表明濃度為0.35 mg/ml或1.75 mg/ml的長(zhǎng)春西汀注射液全身過敏反應(yīng)試驗(yàn)合格。

2.3 被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)［1-3］實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物預(yù)先飼養(yǎng)1周以觀察其活動(dòng)表現(xiàn)，取54只健康大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為六組，每組9只，第一組為生理鹽水組，第二組為5%葡萄糖組，第三組為溶媒組，第四組為陽(yáng)性對(duì)照組(天花粉蛋白2 mg/ml)5 mg/kg，第五、六組分別為長(zhǎng)春西汀(0.2 mg/ml和1 mg/ml)0.5 mg/kg、2.5 mg/kg。

2.3.1 大鼠含IsE的抗血清制備 從每組中各取1只大鼠，按注射劑大鼠同種被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)的要求，分別肌內(nèi)注射上述劑量的生理鹽水、5%葡萄糖、溶媒、天花粉蛋白和長(zhǎng)春西汀大、小劑量，體積均為0.5 ml/只，隔日1次，共3次。末次致敏后第10天，以3%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，2000r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存，備用。

2.3.2 大鼠同種被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 取其余48只健康大鼠，每組8只，分別在各組大鼠背中線兩側(cè)距脊柱約1.5 cm處備皮4 mm×4 mm。取上述含IgE的不同抗血清，用生理鹽水按1∶4和1∶8比例分別稀釋成2個(gè)稀釋度，將稀釋的抗血清按左側(cè)(1∶4比例)、右側(cè)(1∶8比例)注射于大鼠背部預(yù)先備皮部位，每側(cè)注射一個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1 ml。于致敏48 h后，各組尾靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的0.8%伊文思蘭染料共1 ml，進(jìn)行激發(fā)。30 min后處死各組大鼠，測(cè)量皮膚內(nèi)層的藍(lán)色反應(yīng)斑直徑，不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長(zhǎng)徑與短徑之和，直徑大于5 mm者判定為陽(yáng)性，結(jié)果見表3。

由表3結(jié)果可見，生理鹽水、5%葡萄糖組、溶媒、長(zhǎng)春西汀大、小劑量組大鼠背部皮膚均未見藍(lán)色反應(yīng)斑點(diǎn)。陽(yáng)性對(duì)照組注射部位皮膚均不同程度的出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)反應(yīng)，且兩側(cè)(1∶4或1∶8稀釋度)藍(lán)斑直徑均大于5 mm，判定為陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果表明:長(zhǎng)春西汀注射液無(wú)同種被動(dòng)皮膚致敏作用。

2.4 血管刺激性試驗(yàn)［1-3］取健康日本大耳白家兔16只，雌雄各半，隨機(jī)分成四組。按無(wú)菌操作方法于耳緣靜脈滴注(10 ml/kg，1 ml/min)給藥，第一組右耳滴注溶媒生理鹽水溶液，左耳滴注生理鹽水;第二組右耳滴注溶媒5%葡萄糖溶液，左耳滴注5%葡萄糖;第三組右耳滴注長(zhǎng)春西汀生理鹽水溶液0.3 mg/ml，左耳滴注溶媒生理鹽水溶液;第四組右耳滴注長(zhǎng)春西汀5%葡萄糖溶液0.3 mg/ml，左耳滴注溶媒5%葡萄糖溶液，體積均為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)5 d，于每日給藥前及末次給藥后72 h，肉眼觀察注射部位有無(wú)紅腫、充血等刺激現(xiàn)象。處死動(dòng)物，以耳緣靜脈注射點(diǎn)至向心方向(避開注射部位)2 cm，連續(xù)取3段血管連同周圍組織，每段1 cm，用10%甲醛溶液固定，做病理組織學(xué)檢查，觀察靜脈血管組織有無(wú)炎癥反應(yīng)，甚至變性、壞死等顯著性刺激反應(yīng)。另一側(cè)對(duì)照血管同法處理。

表4為血管刺激性試驗(yàn)的結(jié)果，各給藥組4只家兔耳緣靜脈注射部位均未見紅腫、充血等刺激現(xiàn)象。病理組織學(xué)檢查結(jié)果，生理鹽水、5%葡萄糖左耳對(duì)照組，耳緣靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞排列正常，未見層次增多、排列紊亂的改變，血管腔內(nèi)無(wú)附壁血栓，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。管壁內(nèi)、中、外三層結(jié)構(gòu)清晰，可見內(nèi)彈力板，未見纖維組織增生。管壁無(wú)增厚、壞死及炎癥等形態(tài)學(xué)改變，為正常組織結(jié)構(gòu);溶媒和長(zhǎng)春西汀注射液右耳給藥組血管組織結(jié)構(gòu)正常，與左耳對(duì)照組血管比較無(wú)異常改變。

表1 長(zhǎng)春西汀注射液溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 全身主動(dòng)過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 被動(dòng)皮膚過敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 長(zhǎng)春西汀注射液靜脈滴注血管刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)春西汀注射液在0.3 mg/ml濃度時(shí)，未見紅細(xì)胞發(fā)生溶血和凝聚現(xiàn)象;多次靜脈滴注0.3 mg/ml，注射部位血管無(wú)紅腫、充血等刺激性現(xiàn)象，且血管病理組織學(xué)檢查給藥組與對(duì)照組血管組織結(jié)構(gòu)基本相同，未見明顯異常變化;給藥組豚鼠活動(dòng)正常，未見躁動(dòng)、豎毛、咳嗽、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等過敏反應(yīng)癥狀，全身主動(dòng)過敏反應(yīng)陰性。給藥組大鼠背部皮膚均未見藍(lán)色斑點(diǎn)反應(yīng)，即無(wú)同種被動(dòng)皮膚致敏作用。

［1］化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則課題研究組.化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，2005.

［2］梁新麗，等.注射用鹽酸槐定堿對(duì)血管刺激性、溶血、過敏性試驗(yàn)研究.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，8(18):1890.

［3］田日升，等.葛根素注射液的血管刺激性、溶血及過敏性實(shí)驗(yàn)研究.西北藥學(xué)雜志，2009，4(24):278.