章金鳳 李佳林 張麗華

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市第二醫(yī)院，內(nèi)蒙古集寧 012000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010017;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)天奇藥業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古赤峰024000)

組方由酸棗仁、丹參、五味子3味草藥組成，具有補(bǔ)心養(yǎng)肝，安神益智的作用。用于心肝血虛，神經(jīng)衰弱引起的失眠健忘，頭暈，頭痛。為使本產(chǎn)品質(zhì)量更加可控，經(jīng)多次試驗(yàn)，確立了本品中丹參有效成分丹參素鈉含量測定方法，陰性無干擾，經(jīng)方法學(xué)考察，方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗(yàn)均符合有關(guān)規(guī)定。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀:儀器型號 Lab Alliance;檢測器:Model 500;泵:Series III;色譜工作站:ANASTAR;迪馬Column Dimension柱(4.6×250mm ，5μm);AB135－S電子天平;Model C3860A超聲波儀(上海超聲儀器廠)。對照品:丹參素鈉對照品(含量測定用 批號110855－200507)(中國藥品生物制品鑒定所)。試劑:甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為二次蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 波長的選擇:取丹參素鈉對照品適量，加甲醇溶液配成每1mL含0.102mg的溶液，在200～500nm的波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果本品在281nm處有最大吸收。

2.2 色譜條件:色譜柱:迪馬Column Dimension柱(4.6×250mm，5μm)，流動相:甲醇 －乙腈 －磷酸三乙胺水溶液(取純凈水約800mL，置1000mL量瓶中，精密加入磷酸1.70mL振搖，精密加入三乙胺1.80mL，加純凈水稀釋至刻度，搖勻，即得)(5:1:94)

2.3 溶液的制備

對照品溶液的制備:取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含206μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備:取本品適量，研細(xì)，取約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性干擾試驗(yàn):取除丹參外其它藥材按樣品制備方法制成樣品，按供試品溶液的制備方法制成丹參陰性樣品溶液。

精密吸取供試品溶液、陰性液、對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀中，繪制液相色譜圖，由色譜圖提示，在對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性液在此峰位無吸收，對本品中丹參含量測定無干擾，方法專屬性良好，見圖(1～3)。

圖1 丹參素鈉對照品HPLC圖譜

圖2 三味益肝顆粒陰性樣品HPLC圖譜

圖3 三味益肝顆粒樣品HPLC圖譜

2.4 提取溶劑的選擇:取本品適量，研細(xì)，取約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

取本品適量，研細(xì)，取約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

精密吸取上述溶液各10μL，按擬定的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果如下:

表1 提取溶劑的考察結(jié)果

2.5 線性范圍考察精密稱取丹參素鈉對照品于25mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述對照品溶液1、2、3、4、5mL 置10mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得 41.2，22.4，123.6，164.8，206μg·mL－1的對照品溶液，分別進(jìn)樣10μL，測得色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:

Y=4009X －4235 ，r=0.9999。試驗(yàn)結(jié)果如下:

表2 線性范圍考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明丹參素鈉在 41.2 ～206μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積程良好的線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性性試驗(yàn):取樣品(批號081211)研細(xì)，取粉末0.5g，精密稱定，按正文［2.3溶液的制備］項(xiàng)下制備供試液，精密吸取同一供試液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，測定結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果提示:供試液制備后8h內(nèi)測定，色譜峰面積無明顯變化，在此時(shí)間內(nèi)，待測組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn):取同一份供品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。結(jié)果如下:測定結(jié)果表明，本品精密度試驗(yàn)符合有關(guān)規(guī)定。

表4 精密度試驗(yàn)測定結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn):取本品(批號081211)，研細(xì)，分別取粉末2.0g，5份，精密稱定，分別按正文［2.3溶液的制備］項(xiàng)下方法操作，測定，測定結(jié)果見表10。

表5 重現(xiàn)性試驗(yàn)測定結(jié)果

測定結(jié)果表明，本試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)考察:精密稱取本品(批號081211，含量2.00mg·g－1)5份，分別精密加入對照品于樣品中，按［2.3溶液的制備］項(xiàng)下制備供試品溶液，按上述色譜條件依法測定，結(jié)果如下:

表6 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

測定結(jié)果提示:本方法回收率在99.79% ～102.3%之間，RSD為0.24%，符合有關(guān)規(guī)定。

表7 樣品中丹參素鈉含量

2.10 樣品含量測定數(shù)據(jù):經(jīng)采用［2.3溶液的制備］項(xiàng)下方法，測定十批樣品中丹參素鈉的含量，測定結(jié)果見下表。

本品工藝摸索中，10批丹參藥材丹參素含量均高于3%，因此確定丹參含量限度為本品含丹參素不得少于3%。

根據(jù)上述測定結(jié)果，參照工藝中制定的丹參含量限度，我們?nèi)】偲骄康?0%作為本制劑丹參素的限量確定本品每袋含丹參以丹參素計(jì)不得低于2.2mg。

3 討論

3.1 本制劑處方處方中的丹參含有丹參酚酸，丹參酮Ⅱ和丹參素等成分，但前兩者為醇溶性物質(zhì)，而本制劑為水提，所以選用水溶性的丹參素來測定本品的含量。

3.2 檢測波長的選擇:經(jīng)紫外光譜掃描丹參素鈉在281nm有最大吸收，故選用281nm為檢測波長。

3.3 流動相的選擇:參照《中國藥典》2005年版一部丹參藥材含量測定項(xiàng)下及文獻(xiàn)報(bào)道［1］，采用甲醇－乙腈－磷酸三乙胺水溶液(5:2:93)和甲醇－乙腈－磷酸三乙胺水溶液(5:1:94)為流動相，進(jìn)行色譜圖分析，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)后者較前者分離效果好，丹參素鈉與雜質(zhì)峰分離度符合規(guī)定。故選用甲醇－乙腈－磷酸三乙胺水溶液(5:1:94)為流動相。

3.4 樣品提取方法的選擇［2－4］:三味益肝顆粒丹參中丹參素的提取受提取溶劑影響較大，如在相同的提取時(shí)間下分別用甲醇及稀乙醇作為提取溶劑，可發(fā)現(xiàn)兩種溶劑提取丹參素鈉含量相差較大，用甲醇提取較為完全，故選用甲醇為提取溶劑。

方法學(xué)研究表明，采用HPLC法對處方中丹參的丹參素含量進(jìn)行測定，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為三味益肝顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

［1］中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典［S］.2005年版

［2］陳發(fā)奎.常用中草藥有效成分含量測定［M］.人民衛(wèi)生出版社1997.

［3］中華人民共和國國家藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成分制劑)［S］.1998.50.

［4］陰健，郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用(1)［M］.北京:學(xué)苑出版社，1995.168，196，352，468.