劉 柳 趙海洲 董 坤 王文思 段曉林 和紹禹

（云南省蜜蜂資源可持續(xù)利用工程研究中心，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

蜜蜂屬于變溫動物，其體溫隨環(huán)境氣溫變化而變化，單只蜜蜂的體溫正如所有單獨生活的昆蟲一樣，在很大程度上取決于周圍的氣溫[1-3]。尤其在冬天或早春，雖然天氣晴朗，太陽光線刺激蜜蜂出巢，但早晨的氣溫仍然較低，蜜蜂容易受到低溫冷害的影響[4-5]。低溫冷害在不同程度上直接或間接影響蜜蜂的生命活動，因而會使其產(chǎn)生相應(yīng)的生理反應(yīng)[6]。在低溫條件下蜜蜂將停止飛翔，翅肌呈現(xiàn)僵硬，隨著時間延長蜜蜂會陷入凍僵昏迷狀態(tài)，在短時間內(nèi)，如果溫度及時升高，蜜蜂仍可恢復(fù)活力，但如果低溫時間太長，則有致死的危險[1,6]。

目前，有關(guān)蜂群內(nèi)溫度的變化與調(diào)控及其對蜂病的影響或溫度對蜂卵、幼蟲、蜂蓋子及成蟲各發(fā)育階段的影響有很多報道[7-13]，而西方蜜蜂在低溫條件下的行為活動反應(yīng)已有相關(guān)報道[14-15]，但不同蜂種的個體對氣溫的行為反應(yīng)有所差異，目前東方蜜蜂對低溫的行為反應(yīng)尚未見報道[7-16]。本研究擬利用恒溫箱觀察東方蜜蜂在0℃～10℃低溫區(qū)內(nèi)的行為活動反應(yīng)，尤其是足、觸角、翅、吻及腹部等器官和部位在凍僵過程和復(fù)蘇過程中行為活動變化，低溫冷藏條件對蜜蜂凍僵率和恢復(fù)正常率的影響，以期為東方蜜蜂活體標記技術(shù)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本研究于2011年7月～2011年9月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所的實驗室進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試蜂種

實驗蜂種為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所提供的中華蜜蜂，共1群，群勢4～5脾。

1.2.2 儀器設(shè)備

本研究室內(nèi)使用儀器包括：恒溫箱（溫度范圍0℃～50℃，波動范圍≤±0.5℃）、玻璃試管（直徑為30mm）、計時器、室內(nèi)溫度計、室外溫度計、蜂帽等。

1.3 試驗方法

利用恒溫箱提供實驗所需的低溫環(huán)境（0℃～10℃），冷藏溫度分別設(shè)為0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃，每個溫度下的冷藏時間均設(shè)為3 min、5 min、7 min、9 min、11 min、13 min、15 min、17 min，而每個溫度下的最長冷藏時間因冷藏效果而異，直至每個溫度下冷藏的所有蜜蜂完全凍僵。試驗中，5只東方蜜蜂作為一組，盛放在帶有棉塞的玻璃試管內(nèi)并置于恒溫箱中，每個溫度下不同冷藏時間重復(fù)2次。在相應(yīng)的冷藏溫度和冷藏時間下觀察并記錄蜜蜂個體行為活動的變化，尤其吻、觸角、翅肌、腹部、足等器官或部位的行為活動變化情況以及凍僵的比例，當(dāng)冷藏時間結(jié)束時，將盛有蜜蜂的試管從恒溫箱中取出并置于木板上，在室溫條件下觀察20 min，描述冷藏狀態(tài)的蜜蜂恢復(fù)過程，尤其吻、觸角、翅肌、腹部、足等器官或部位的行為活動變化，并記錄每只蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間及恢復(fù)正常蜜蜂所占比例。

某一冷藏溫度和冷藏時間下的蜜蜂完全凍僵率計算公式如下：

完全凍僵率=處于完全凍僵狀態(tài)的蜜蜂數(shù)量/供試蜜蜂數(shù)量

某一冷藏溫度下經(jīng)過一定的冷藏時間后，室溫下蜜蜂恢復(fù)正常率計算公式如下：

恢復(fù)正常率=不同凍僵狀態(tài)下的蜜蜂恢復(fù)至正常狀態(tài)數(shù)量/供試蜜蜂數(shù)量

2 結(jié)果與分析

2.1 東方蜜蜂完全凍僵過程及其行為活動變化

試驗中，將盛有5只東方蜜蜂且?guī)в忻奕牟Ａг嚬苤糜诤銣叵渲?，隨著冷藏時間的延長，試管中活動正常的蜜蜂個體逐漸呈僵遲狀態(tài)，隨著冷藏時間的繼續(xù)延長，活動僵遲的蜜蜂個體逐漸陷入昏迷狀態(tài)直至軀體完全凍僵側(cè)倒于玻璃試管內(nèi)壁。從東方蜜蜂行為活動變化看，其完全凍僵過程大致可分為輕度凍僵、中度凍僵、重度凍僵和完全凍僵四個階段。

2.1.1 輕度凍僵

隨著冷藏時間的延長，試管中積極正常的蜜蜂個體逐漸陷入僵遲狀態(tài)，爬行遲緩，不振翅，腹部抖動（節(jié)律性的振動）頻率明顯減慢，此時觸角的柄節(jié)、梗節(jié)至鞭節(jié)呈180°打直狀態(tài)，且兩觸角的柄節(jié)間的夾角呈鈍角，伸向兩側(cè)，其整個觸角的靈動性明顯降低。

2.1.2 中度凍僵

在恒溫箱中繼續(xù)冷藏，蜜蜂陷入中度凍僵過程，不爬行，足部各節(jié)收攏；不振翅，兩翅趨于合攏，微張并覆于蜜蜂的背部；腹部抖動頻率較低且向腹面微彎；兩觸角的柄節(jié)間夾角由鈍角逐漸縮小，其靈動性較低且鞭節(jié)向柄節(jié)收攏。

2.1.3 重度凍僵

隨著冷藏時間的延長，蜜蜂陷入昏迷狀態(tài)側(cè)倒于試管壁，三對足各節(jié)緊縮，偶爾抖動；兩翅合攏疊搭，覆于蜜蜂的腹部背面，不振翅；腹部緊縮，更彎向腹面，偶爾抖動；觸角鞭節(jié)繼續(xù)折向柄節(jié)，趨于合攏，兩觸角的柄節(jié)間夾角逐漸縮小至銳角狀，由兩側(cè)伸向中間，基本不動。

2.1.4 完全凍僵

一段時間后，試管中的蜜蜂完全凍僵，伸吻，每對足相互緊抱，各器官或部位完全停止運動，側(cè)倒于試管壁，整個身體緊縮，呈C型彎曲；觸角鞭節(jié)折向柄節(jié)，接近合攏但并未完全合攏，兩觸角柄節(jié)移向額部中間趨于合攏，兩個觸角完全不動。

2.2 完全凍僵的東方蜜蜂復(fù)蘇過程及其行為活動變化

將盛有5只完全凍僵的東方蜜蜂且?guī)в忻奕牟Ａг嚬軓暮銣叵渲腥〕霾⒃嚬軆?nèi)的蜜蜂倒置于木板上，隨著時間的延長，凍僵的蜜蜂的吻、觸角、翅肌、腹部、足等器官或部位的行為活動逐漸復(fù)蘇萌動，隨著復(fù)蘇時間的繼續(xù)延長，蜜蜂完全蘇醒直至恢復(fù)積極狀態(tài)，能振翅飛行。根據(jù)蜜蜂行為活動變化，完全凍僵的東方蜜蜂復(fù)蘇過程可分為復(fù)蘇萌動、完全蘇醒、積極狀態(tài)三個階段。

2.2.1 復(fù)蘇萌動

完全凍僵的蜜蜂，處于昏厥狀態(tài)，在室溫下很快開始復(fù)蘇，其腹部抖動頻率逐漸增大，觸角極其緩慢的做小幅抖動，其鞭節(jié)處緩慢地遠離柄節(jié)處，柄節(jié)、梗節(jié)、鞭節(jié)呈180°打直狀態(tài)，三對足逐漸的向腹部兩側(cè)伸展，合攏的雙翅逐漸向身體兩側(cè)伸展，此時其頭部和腹部相對，整只蜜蜂呈蜷縮狀，伸出的吻逐漸縮回，蜷縮的身體逐漸伸展開來，其足又逐漸的向腹部兩側(cè)伸展，準備翻身直立。

2.2.2 完全蘇醒

蜜蜂傾斜的身體逐漸翻身呈直立狀態(tài)，三對足無力地支撐整個身體的重量，趴在木板上，后又逐漸恢復(fù)體力，三對足佇立在原地，不爬行，雙翅合攏，亦不振翅，觸角呈打直狀態(tài)，兩個觸角柄節(jié)間的夾角逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)的鈍角形，運動靈活且抖動頻數(shù)逐漸增加，腹部不斷的抖動。

2.2.3 積極狀態(tài)

完全蘇醒的蜜蜂逐漸恢復(fù)至積極狀態(tài)，十分活躍，觸角極其靈動，腹部恢復(fù)到正常狀態(tài)下節(jié)律性的振動，爬行十分靈活，即時振翅飛行。

2.3 冷藏條件對東方蜜蜂凍僵效果和恢復(fù)效果的影響

2.3.1 冷藏條件對蜜蜂完全凍僵率和恢復(fù)正常率的影響

本試驗選擇0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃ 6種溫度冷藏蜜蜂，冷藏后的蜜蜂室溫下進行復(fù)蘇。由圖1可知，當(dāng)冷藏溫度一定時，隨著冷藏時間的延長，完全凍僵的蜜蜂比例逐漸增加，而冷藏后室溫下能恢復(fù)正常的蜜蜂比例逐漸降低；但10℃冷藏3～17 min，所有蜜蜂均未出現(xiàn)完全凍僵現(xiàn)象，10℃冷藏時間超過13 min后，冷藏后的蜜蜂有一部份不能再恢復(fù)正常而死亡；當(dāng)冷藏時間一定時，冷藏的溫度越低，蜜蜂完全凍僵比例越高，同時蜜蜂完全凍僵狀態(tài)出現(xiàn)的越早，而冷藏后室溫下蜜蜂復(fù)蘇的過程恰好相反，當(dāng)冷藏時間一定時，冷藏的溫度越高，恢復(fù)正常的蜜蜂比例也越高，同時蜜蜂恢復(fù)正常所需的時間較短。0℃、2℃下冷藏蜜蜂，冷藏時間超過15 min后，蜜蜂完全凍僵率達到100%。而當(dāng)冷藏時間達到15 min時，0℃、2℃下冷藏的蜜蜂，約有一半個體室溫下不能恢復(fù)正常，不久后死亡。事實上從圖中可以看出，在6種冷藏溫度下，當(dāng)冷藏時間短于7 min時，室溫下蜜蜂恢復(fù)正常的比例為100%，9～13 min時，蜜蜂恢復(fù)正常的比例開始出現(xiàn)下降，當(dāng)達到17 min時，蜜蜂恢復(fù)正常的比例為50%左右。綜合考慮蜜蜂完全凍僵率和恢復(fù)正常率，在0℃、2℃下冷藏11～13 min時，蜜蜂完全凍僵率和凍僵后室溫下恢復(fù)正常率均最高，可作為東方蜜蜂活體標記技術(shù)的最佳冷藏條件。

2.3.2 冷藏條件對蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間的影響

從表1可以看出，冷藏溫度和冷藏時間對室溫條件下蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需的時間有較大影響?？傮w上當(dāng)冷藏時間一定時，冷藏溫度愈高，蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間愈短；而當(dāng)冷藏溫度一定時，隨著冷藏時間的增加，蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間愈長。結(jié)合圖1，當(dāng)蜜蜂完全凍僵率和凍僵后室溫下恢復(fù)正常率均較高時，也就是在0℃下冷藏11 min或13 min時，蜜蜂完全凍僵率分別為70%和80%，室溫下恢復(fù)正常率均為60%，而蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間分別為423 s（約7.1 min）和462 s（約7.7 min）。在2℃下冷藏11 min或13 min時，蜜蜂完全凍僵率分別為60%和70%，室溫下恢復(fù)正常率分別為70%和60%，而蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間分別為242 s（約4.0 min）和245 s（約4.1 min）。

表1 蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間（s）

3 討論

單只蜜蜂的體溫在很大程度上取決于周圍的氣溫,且不同蜂種個體對氣溫的反應(yīng)有所差異[3]。如中蜂個體臨界安全溫度為10℃ ，意蜂的臨界安全溫度為13℃ ，意蜂個體在13℃ 以下呈現(xiàn)僵硬，蜜蜂逐漸停止飛翔，而中蜂在10～11℃ 時，可以外出飛行[4]。而西方蜜蜂對低溫的反應(yīng)，氣溫在7～9℃下，單個蜜蜂陷入輕度凍僵；在4～5℃，開始完全凍僵；在2～5℃ ，15～20 min后完全凍僵[6]。本試驗在0～10℃ 范圍內(nèi)將蜜蜂置于恒溫箱內(nèi)，研究了東方蜜蜂對低溫的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在0～10℃ 范圍內(nèi)隨著冷藏時間的延長，蜜蜂都會經(jīng)歷輕度凍僵直至身體完全凍僵的過程，蜜蜂對低溫的抗寒能力受溫度和冷藏時間兩方面的共同影響，溫度越低冷藏時間越長，蜜蜂的完全凍僵率越高，而溫度越高冷藏時間越短，蜜蜂的完全凍僵率越低，在所設(shè)定的6種溫度下冷藏3～5 min，均未出現(xiàn)完全凍僵的個體。但總體看來，東方蜜蜂在0～4℃, 5～7 min開始動作遲鈍，輕度凍僵，7～11 min開始出現(xiàn)完全凍僵的現(xiàn)象；6～8℃，5～7 min開始動作遲鈍，輕度凍僵，13～17 min開始出現(xiàn)完全凍僵現(xiàn)象；冷藏溫度在10℃時，7～9 min開始動作遲鈍，輕度凍僵，21 min后開始出現(xiàn)完全凍僵的現(xiàn)象。

試驗中，不同的蜜蜂個體對低溫的抵抗能力存在一定差異，在相同的冷藏條件下，一些個體凍僵的速度較慢，而復(fù)蘇過程中恢復(fù)至正常狀態(tài)所需的時間較短。我們推測除了遺傳變異的因素外，這種現(xiàn)象可能由于采集蜂的日齡及蜜囊內(nèi)的儲蜜量的差異造成的。

目前，用于快速準確標記活體蜜蜂的方法甚是有限，現(xiàn)使用的有CO2熏暈法和低溫冷藏凍僵法[1]。但是用CO2熏暈法進行活體蜜蜂標記仍存在一定的問題：1）CO2的試驗成本高；2）使用CO2熏暈蜜蜂時，其使用量難以得到相應(yīng)的控制，倘若CO2使用過量，就會導(dǎo)致實驗蜂死亡，且使用CO2熏暈的蜜蜂復(fù)蘇的迅速，難以達到快速準確標記活體蜜蜂的目的。低溫冷藏凍僵法現(xiàn)已應(yīng)用于西方蜜蜂活體標記以開展相關(guān)試驗，而在東方蜜蜂活體標記應(yīng)用較少[16]。本試驗通過對東方蜜蜂在低溫區(qū)的行為反應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)不同冷藏條件不僅影響到蜜蜂凍僵比例同時也會影響到凍藏后的蜜蜂恢復(fù)正常的比例。因此，本試驗的結(jié)果為東方蜜蜂活體標記提供了理論依據(jù)。

根據(jù)本試驗的觀察，低溫對蜜蜂吻、觸角、翅、腹部、足等器官和部位的行為活動會產(chǎn)生不同程度的影響。雖然這些器官和部位隨著冷藏時間的延長都會從正?；顒訝顟B(tài)進入遲緩狀態(tài)直至完全停止活動，但其完全凍僵出現(xiàn)的時間并不一致，其先后順序依次為：足、翅、腹部、觸角、吻，就足而言，其凍僵的順序為前足、中足、后足。完全凍僵的蜜蜂在室溫下復(fù)蘇時腹部、觸角、后足、中足、前足、翅、吻等器官和部位依次恢復(fù)活動功能直至身體完全恢復(fù)到正常的積極狀態(tài)而振翅起飛。因此我們推斷，吻、觸角、翅、腹部、足等器官和部位對低溫的抵抗能力存在著一定的差異。蜜蜂的試驗中觀察到，東方蜜蜂在復(fù)蘇過程中經(jīng)常會出現(xiàn)2-3只蜜蜂交流的現(xiàn)象。當(dāng)2只蜜蜂交流時，首先一只蜜蜂表現(xiàn)為主動伸吻，而另一只蜜蜂則表現(xiàn)為被動伸吻，2只蜜蜂的吻頻繁接觸，同時觸角相互快速頻繁觸碰，然后前足相擁緊抱或頻繁接觸，這種交流持續(xù)大約2～3 min；主動伸吻的蜜蜂通常是恢復(fù)較快、爬行靈活的蜜蜂，但交流結(jié)束后，通常被動伸吻的蜜蜂能夠恢復(fù)正常，而主動伸吻的蜜蜂最終不能恢復(fù)正常而死亡。當(dāng)2只蜜蜂進行交流時，偶爾會引來第三只爬行靈活的蜜蜂，對著2只正在交流的蜜蜂主動伸吻，但通常情況下，“第三者”都難以參與進2只蜜蜂間的交流，1～2 min后便主動地離開。我們推測交流的蜜蜂之間可能存在食物的傳遞，但完全凍僵的蜜蜂在復(fù)蘇過程中出現(xiàn)交流現(xiàn)象的機制及其意義還有待進一步的研究。

4 結(jié)論

（1）根據(jù)觀察，東方蜜蜂在完全凍僵過程和復(fù)蘇過程中，其足、觸角、翅、吻及腹部等器官和部位均發(fā)生了較為復(fù)雜的行為活動變化，蜜蜂凍僵過程大致可分為輕度凍僵、中度凍僵、重度凍僵和完全凍僵四個階段，而完全凍僵的蜜蜂復(fù)蘇過程可分為復(fù)蘇萌動、完全蘇醒、積極狀態(tài)三個階段。

（2）從冷藏條件對東方蜜蜂凍僵效果和恢復(fù)效果的影響來看，當(dāng)冷藏溫度一定時，隨著冷藏時間的延長，完全凍僵的蜜蜂比例逐漸增加，而冷藏后室溫下能恢復(fù)正常的蜜蜂比例逐漸降低；當(dāng)冷藏時間一定時，冷藏的溫度越低，蜜蜂完全凍僵比例越高，同時蜜蜂完全凍僵狀態(tài)出現(xiàn)的越早，而冷藏后室溫下蜜蜂復(fù)蘇的過程恰好相反，冷藏的溫度越高，恢復(fù)正常的蜜蜂比例也越高。從冷藏條件對蜜蜂復(fù)蘇時間的影響看，總體上當(dāng)冷藏時間一定時，冷藏溫度愈高，蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間愈短，當(dāng)冷藏溫度一定時，隨著冷藏時間的增加，蜜蜂恢復(fù)至振翅飛行所需時間愈長。

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