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        液相色譜-同位素質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中糖組分δ13C值

        2012-11-28 09:58:32李學(xué)民曹彥忠賈光群張進(jìn)杰錢小清王賀琴
        中國(guó)蜂業(yè) 2012年1期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)偏差質(zhì)譜法同位素

        李學(xué)民 曹彥忠 賈光群 張進(jìn)杰 錢小清 王賀琴

        (秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局,河北 秦皇島 066004)

        蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結(jié)合后,經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。其保健效果與醫(yī)療作用為人們所共識(shí)。近年來,由于氣候異常蜂蜜產(chǎn)量下降,人工與原料成本加大,導(dǎo)致蜂產(chǎn)品價(jià)格上漲,國(guó)內(nèi)外消費(fèi)需求量增加,出現(xiàn)了少數(shù)不法商販以次充好、摻雜使假的欺騙行為。主要做法是把價(jià)格低廉的糖、糖漿等摻入純正蜂蜜中,破壞了蜂蜜純天然保健品屬性,對(duì)蜂蜜真實(shí)性健康消費(fèi)造成嚴(yán)重?fù)p害。蜂蜜真實(shí)性檢測(cè)成為急需解決的技術(shù)問題。

        蜂蜜真實(shí)性檢測(cè)方法有氣相色譜法[2]、薄層色譜法[3]、分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、點(diǎn)特異性天然同位素分餾核磁共振法[7,8]、傅里葉變換紅外光譜法[9]、糖類指紋圖譜法[10]、差示掃描量熱法[11]、近紅外光譜法[12]、氨基酸指紋圖譜法[13]、穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜法[14-17]。通過感官檢驗(yàn)以及分析蜂蜜不同理化指標(biāo),如糖分、酶值、羥甲基糠醛、脯氨酸等,經(jīng)與純正天然蜂蜜指標(biāo)比較對(duì)照,判斷蜂蜜摻假。然而,該方法耗時(shí)長(zhǎng),靈敏度僅可滿足簡(jiǎn)單的摻假事件,不適合蜂蜜摻假的高通量檢測(cè)。

        隨著穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用于蜂蜜摻假檢測(cè),不法分子摻假手段由以前使用C-4糖,如玉米糖、蔗糖,改為使用C-3植物糖漿,如大米糖漿。原有方法對(duì)此無能為力。液相色譜-同位素質(zhì)譜法采用液相色譜分離,在線測(cè)定蜂蜜中各糖組分δ13C值,提高了檢測(cè)靈敏度。測(cè)定結(jié)果與純正蜂蜜各組分δ13C的差值分布區(qū)間對(duì)比,檢測(cè)蜂蜜摻假。目前,國(guó)外已有實(shí)驗(yàn)室利用液相色譜-同位素質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)蜂蜜中糖組分δ13C值的研究與應(yīng)用[16,17],因此,建立蜂蜜中各糖組分δ13C值測(cè)定方法非常必要。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        美國(guó)Thermo Fisher公司DELTA V Plus同位素質(zhì)譜儀,配備Surveryor 液相色譜與Isolink接口。

        LC-IRMS使用的超純水由Millipore公司制造的Milli-Q系統(tǒng)制備。正磷酸(純度≥99%)、過二硫酸鈉(純度≥99%)均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;He氣(高純99.999%,載氣)購(gòu)于北京市亞南氣體有限公司;CO2氣 (工作標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)?購(gòu)于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

        化學(xué)氧化試劑,0.2 M磷酸和0.2 M過二硫酸鈉溶液,存于棕色瓶?jī)?nèi)。用前需使用超聲波和真空過濾脫氣。蔗糖 IAEA-CH6(δ13C值: –10.4‰)購(gòu)于奧地利維也納國(guó)際原子能機(jī)構(gòu),作為碳穩(wěn)定同位素參照標(biāo)準(zhǔn),由SerCon公司提供。

        1.2 樣品處理

        稱取200 mg 蜂蜜樣品以超純水溶解,定容至50 ml,過0.45 μm 濾膜至樣品瓶供液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測(cè)定。樣品溶液必須每天新鮮制備。

        1.3 色譜、質(zhì)譜條件

        1.3.1 色譜條件

        樣品溶液進(jìn)樣體積為10 μl,色譜柱為Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)300×8mm,洗脫劑為100%的超純水,流速為0.3 ml/min,磷酸溶液和化學(xué)氧化劑的濃度均為0.2 M,在流速0.04 ml/min的條件下,產(chǎn)生適量的氧氣,其信號(hào)強(qiáng)度在8-10V之間。在洗脫劑與化學(xué)氧化劑的容器瓶?jī)?nèi)始終保持氦氣流,防止來自大氣中CO2的污染。氦氣的載氣壓力為0.5 bar,Isolink接口內(nèi)吹掃氣壓力為1.2 bar,CO2標(biāo)準(zhǔn)氣壓力為1.2 bar,信號(hào)強(qiáng)度在6V左右。氧化反應(yīng)器溫度為99.9 ℃,色譜柱柱箱溫度為65 ℃。

        1.3.2 質(zhì)譜條件

        離子源:EI離子源;掃描方式:正離子掃描;輔助氣壓力:0.4MPa; 轟擊電壓:120.8 eV;

        離子源電壓:2.97KV;真空度:2.0×e-6 mbar。在每次運(yùn)行前測(cè)定三次CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)猓看?0s)。一次測(cè)定約40 min。在儀器運(yùn)行中,Thermo Electron Isodat version 3.0軟件用于數(shù)據(jù)處理和計(jì)算δ13C。

        1.3.3 校準(zhǔn)與計(jì)算

        由于IAEA-CH6是限制購(gòu)買產(chǎn)品,因此使用IAEA-CH6碳穩(wěn)定同位素參考標(biāo)準(zhǔn)(δ13C值:–10.4‰)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作標(biāo)準(zhǔn)(葡萄糖水合物,δ13C值: –26.03±0.2‰)進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)定,再使用該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CO2氣體進(jìn)行標(biāo)定,每次測(cè)定樣品使用CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)怏w計(jì)算δ13C值。在每次樣品測(cè)定時(shí),至少測(cè)定一次實(shí)驗(yàn)室工作標(biāo)準(zhǔn)(葡萄糖水合物),同時(shí)測(cè)定實(shí)驗(yàn)室蜂蜜質(zhì)控樣品。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 蜂蜜中各種糖組分液相色譜分離條件的選擇

        由于穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜儀具有很高的靈敏度,對(duì)于含有碳有機(jī)物與無機(jī)物,在測(cè)定時(shí)給質(zhì)譜儀造成較高水平的背景干擾,因此,蜂蜜糖組分檢測(cè)不使用氨基柱分離、水和乙腈混合作為洗脫劑。苯乙烯-二乙烯基苯聚合物色譜柱裝載陽離子(Ca2+、Pb2+、Na+或 H+),使用超純水作為洗脫劑是較好的選擇。

        通過實(shí)驗(yàn)比較,反相色譜柱、長(zhǎng)柱(300×8 mm)、低流速(<0.6 ml/min)和保持適當(dāng)?shù)闹鶞孬@得較好分離效果。由于適合糖組分分離的色譜柱可選類型與范圍較小,柱溫優(yōu)選對(duì)建立合理色譜分離非常重要。當(dāng)柱溫較低(30℃)時(shí),輸液系統(tǒng)壓力增大,容易發(fā)生漏液,測(cè)定結(jié)果重復(fù)性不好;果糖、葡萄糖氧化不完全,并且測(cè)定周期長(zhǎng),每個(gè)測(cè)試樣品需60 min以上,既造成浪費(fèi)又降低了工作效率。當(dāng)柱溫較高(80℃)時(shí),雖然縮短了檢測(cè)周期,但某些糖類容易水解,峰形變差,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn),影響定量;這些因素導(dǎo)致δ13C值不可靠。把柱溫選定65℃時(shí),被測(cè)組分各峰分離度與峰形均達(dá)到最佳效果,測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好,因此最佳的色譜柱溫度選定65℃。

        選擇裝載Ca2+離子的色譜柱,對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定,獲得了較好的基線與分離效果(見圖1),其中二糖包括蔗糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽糖和海藻糖,三糖包括吡喃葡糖基蔗糖,松三糖, 麥芽三糖 和蜜三糖。更換裝載不同離子(Ca2+, Pb2+, Na+或 H+)的色譜柱進(jìn)樣測(cè)定,比較分析各糖組分的色譜行為,糖組分峰形及分離僅有輕微變化,沒有一種色譜柱能夠?qū)⒎涿蹣悠钒蟹N類的二糖與三糖完全分離。綜上所述,本方法選擇Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)300×8mm作為蜂蜜中糖組分的色譜分離柱。

        2.2 液相色譜-同位素質(zhì)譜法測(cè)定精度

        在每次樣品測(cè)定時(shí)均測(cè)定蜂蜜質(zhì)控樣品,統(tǒng)計(jì)3個(gè)月內(nèi),測(cè)定65個(gè)不同日期獲得質(zhì)控樣品各糖組分的δ13C值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,測(cè)定結(jié)果見表1。

        按照前述方法測(cè)定,果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1~0.5‰。在表1看出,二糖和三糖標(biāo)準(zhǔn)偏差比果糖、葡萄糖稍微高一些,是由于它們?cè)诜涿壑泻肯喈?dāng)?shù)颓易鳛榭偡鍦y(cè)定,同時(shí)諸如LC系統(tǒng)、色譜分離、化學(xué)氧化、CO2氣體分離單元等因素也存在造成偏差增大的可能性。對(duì)于日常蜂蜜分析,表1中標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)說明,LCIRMS法完全可以滿足蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值測(cè)定要求。

        2.3 純正蜂蜜各組分Δδ13C值分布區(qū)間的確定

        應(yīng)用元素分析-同位素質(zhì)譜法(EA-IRMS)與液相色譜-同位素質(zhì)譜法(LC-IRMS)相結(jié)合,對(duì)采自全國(guó)26個(gè)省及地區(qū)、20個(gè)不同蜜種385個(gè)純正蜂蜜樣品中蜂蜜、蛋白質(zhì)及各糖組分δ13C值進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定結(jié)果見表2。從表2看出,各種純正蜂蜜樣品,在蜂蜜、蛋白質(zhì)、果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值的平均值之間有較小差異,見表3。蜂蜜中各組分δ13C值標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過1‰,應(yīng)用各組分δ13C值的差值(Δδ13C 值)檢測(cè)蜂蜜摻假是適合的。

        表1 LC-IRMS法在3個(gè)月內(nèi)測(cè)定質(zhì)控樣品重現(xiàn)性數(shù)據(jù)(n=65)

        表2 EA/LC-IRMS法純正蜂蜜的測(cè)定結(jié)果(n=385)

        表3 表2中純正蜂蜜樣品δ13C值的差值(Δδ13C 值)(n=385)

        385個(gè)純正蜂蜜各糖組分Δδ13C測(cè)定結(jié)果列于表3,從表2、3可以看出,所有的Δδ13C的平均值低于±1.0‰,標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.7‰。通過大量純正蜂蜜檢測(cè),在任何情況下,獲得的最大差值不超過2.1‰,因此,在檢測(cè)大量不同地區(qū)、不同蜜種的純正蜂蜜基礎(chǔ)上,獲得我國(guó)純正蜂蜜各組分Δδ13C分布區(qū)間同時(shí)滿足:Δδ13Cfru–glu=±1.0‰、Δδ13Cp–h≥–1.0‰、Δδ13Cmax.= ±2.1‰。該結(jié)論與文獻(xiàn)[17]中Elflein研究結(jié)論相符。

        2.4 蜂蜜摻假檢測(cè)應(yīng)用

        應(yīng)用EA/LC-IRMS法和純正蜂蜜各組分Δδ13C分布區(qū)間,在2010年2月至2011年5月對(duì)243個(gè)(委托樣品)懷疑使用糖漿摻假的蜂蜜樣品完成檢測(cè)。利用已有的EA-IRMS法,測(cè)定蜂蜜和蛋白質(zhì)的δ13C值,計(jì)算C-4植物糖含量,C-4植物糖不合格的樣品11個(gè),檢測(cè)摻假只有4.5%。利用EA/LCIRMS法檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果按照純正蜂蜜判定準(zhǔn)則進(jìn)行判定時(shí),85個(gè)樣品不合格,檢測(cè)摻假達(dá)到35%,本方法蜂蜜摻假檢出率遠(yuǎn)高于原來方法。

        2009年9月至2011年9月,應(yīng)用本方法為全國(guó)87家蜂產(chǎn)品加工與出口單位檢測(cè)蜂蜜樣品1500多個(gè)批次,對(duì)檢測(cè)結(jié)果均未提出異議,也未出現(xiàn)由于檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)導(dǎo)致國(guó)外退賠現(xiàn)象,有效促進(jìn)了蜂蜜出口。

        3 結(jié)論

        利用該方法對(duì)我國(guó)26個(gè)省及地區(qū)、20個(gè)不同蜜種385個(gè)純正蜂蜜樣品中蜂蜜、蛋白質(zhì)及各糖組分δ13C值進(jìn)行檢測(cè),通過統(tǒng)計(jì)分析,確定了我國(guó)純正蜂蜜Δδ13C值分布區(qū)間,為提高我國(guó)蜂產(chǎn)品質(zhì)量,鑒別蜂蜜摻假提供了技術(shù)手段。

        [1]GB 18796-2005.Honey.National Standards of the People’s Republic of China (蜂蜜:國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)).

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