李學(xué)民 曹彥忠 賈光群 張進(jìn)杰 錢小清 王賀琴

（秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北 秦皇島 066004）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。其保健效果與醫(yī)療作用為人們所共識。近年來，由于氣候異常蜂蜜產(chǎn)量下降，人工與原料成本加大，導(dǎo)致蜂產(chǎn)品價格上漲，國內(nèi)外消費需求量增加，出現(xiàn)了少數(shù)不法商販以次充好、摻雜使假的欺騙行為。主要做法是把價格低廉的糖、糖漿等摻入純正蜂蜜中，破壞了蜂蜜純天然保健品屬性，對蜂蜜真實性健康消費造成嚴(yán)重?fù)p害。蜂蜜真實性檢測成為急需解決的技術(shù)問題。

蜂蜜真實性檢測方法有氣相色譜法[2]、薄層色譜法[3]、分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、點特異性天然同位素分餾核磁共振法[7,8]、傅里葉變換紅外光譜法[9]、糖類指紋圖譜法[10]、差示掃描量熱法[11]、近紅外光譜法[12]、氨基酸指紋圖譜法[13]、穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜法[14-17]。通過感官檢驗以及分析蜂蜜不同理化指標(biāo)，如糖分、酶值、羥甲基糠醛、脯氨酸等，經(jīng)與純正天然蜂蜜指標(biāo)比較對照，判斷蜂蜜摻假。然而，該方法耗時長，靈敏度僅可滿足簡單的摻假事件，不適合蜂蜜摻假的高通量檢測。

隨著穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜檢測技術(shù)運用于蜂蜜摻假檢測，不法分子摻假手段由以前使用C-4糖，如玉米糖、蔗糖，改為使用C-3植物糖漿，如大米糖漿。原有方法對此無能為力。液相色譜-同位素質(zhì)譜法采用液相色譜分離，在線測定蜂蜜中各糖組分δ13C值，提高了檢測靈敏度。測定結(jié)果與純正蜂蜜各組分δ13C的差值分布區(qū)間對比，檢測蜂蜜摻假。目前，國外已有實驗室利用液相色譜-同位素質(zhì)譜技術(shù)檢測蜂蜜中糖組分δ13C值的研究與應(yīng)用[16,17]，因此，建立蜂蜜中各糖組分δ13C值測定方法非常必要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Thermo Fisher公司DELTA V Plus同位素質(zhì)譜儀，配備Surveryor 液相色譜與Isolink接口。

LC-IRMS使用的超純水由Millipore公司制造的Milli-Q系統(tǒng)制備。正磷酸(純度≥99%)、過二硫酸鈉(純度≥99%)均購于Sigma-Aldrich公司；He氣(高純99.999%，載氣)購于北京市亞南氣體有限公司；CO2氣 (工作標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)?購于中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

化學(xué)氧化試劑，0.2 M磷酸和0.2 M過二硫酸鈉溶液，存于棕色瓶內(nèi)。用前需使用超聲波和真空過濾脫氣。蔗糖 IAEA-CH6(δ13C值: –10.4‰)購于奧地利維也納國際原子能機(jī)構(gòu)，作為碳穩(wěn)定同位素參照標(biāo)準(zhǔn)，由SerCon公司提供。

1.2 樣品處理

稱取200 mg 蜂蜜樣品以超純水溶解，定容至50 ml，過0.45 μm 濾膜至樣品瓶供液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測定。樣品溶液必須每天新鮮制備。

1.3 色譜、質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

樣品溶液進(jìn)樣體積為10 μl，色譜柱為Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)300×8mm，洗脫劑為100%的超純水，流速為0.3 ml/min，磷酸溶液和化學(xué)氧化劑的濃度均為0.2 M，在流速0.04 ml/min的條件下，產(chǎn)生適量的氧氣，其信號強(qiáng)度在8-10V之間。在洗脫劑與化學(xué)氧化劑的容器瓶內(nèi)始終保持氦氣流，防止來自大氣中CO2的污染。氦氣的載氣壓力為0.5 bar，Isolink接口內(nèi)吹掃氣壓力為1.2 bar，CO2標(biāo)準(zhǔn)氣壓力為1.2 bar，信號強(qiáng)度在6V左右。氧化反應(yīng)器溫度為99.9 ℃，色譜柱柱箱溫度為65 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：EI離子源；掃描方式：正離子掃描；輔助氣壓力：0.4MPa； 轟擊電壓：120.8 eV；

離子源電壓：2.97KV；真空度：2.0×e-6 mbar。在每次運行前測定三次CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)猓看?0s）。一次測定約40 min。在儀器運行中，Thermo Electron Isodat version 3.0軟件用于數(shù)據(jù)處理和計算δ13C。

1.3.3 校準(zhǔn)與計算

由于IAEA-CH6是限制購買產(chǎn)品，因此使用IAEA-CH6碳穩(wěn)定同位素參考標(biāo)準(zhǔn)(δ13C值:–10.4‰)對實驗室工作標(biāo)準(zhǔn)（葡萄糖水合物，δ13C值: –26.03±0.2‰）進(jìn)行校準(zhǔn)測定，再使用該標(biāo)準(zhǔn)對CO2氣體進(jìn)行標(biāo)定，每次測定樣品使用CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)怏w計算δ13C值。在每次樣品測定時，至少測定一次實驗室工作標(biāo)準(zhǔn)（葡萄糖水合物），同時測定實驗室蜂蜜質(zhì)控樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂蜜中各種糖組分液相色譜分離條件的選擇

由于穩(wěn)定碳同位素質(zhì)譜儀具有很高的靈敏度，對于含有碳有機(jī)物與無機(jī)物，在測定時給質(zhì)譜儀造成較高水平的背景干擾，因此，蜂蜜糖組分檢測不使用氨基柱分離、水和乙腈混合作為洗脫劑。苯乙烯-二乙烯基苯聚合物色譜柱裝載陽離子（Ca2+、Pb2+、Na+或 H+），使用超純水作為洗脫劑是較好的選擇。

通過實驗比較，反相色譜柱、長柱(300×8 mm)、低流速(＜0.6 ml/min)和保持適當(dāng)?shù)闹鶞孬@得較好分離效果。由于適合糖組分分離的色譜柱可選類型與范圍較小，柱溫優(yōu)選對建立合理色譜分離非常重要。當(dāng)柱溫較低（30℃）時，輸液系統(tǒng)壓力增大，容易發(fā)生漏液，測定結(jié)果重復(fù)性不好；果糖、葡萄糖氧化不完全，并且測定周期長，每個測試樣品需60 min以上，既造成浪費又降低了工作效率。當(dāng)柱溫較高（80℃）時，雖然縮短了檢測周期，但某些糖類容易水解，峰形變差，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)，影響定量；這些因素導(dǎo)致δ13C值不可靠。把柱溫選定65℃時，被測組分各峰分離度與峰形均達(dá)到最佳效果，測定結(jié)果重復(fù)性較好，因此最佳的色譜柱溫度選定65℃。

選擇裝載Ca2+離子的色譜柱，對蜂蜜樣品進(jìn)行測定，獲得了較好的基線與分離效果(見圖1)，其中二糖包括蔗糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽糖和海藻糖，三糖包括吡喃葡糖基蔗糖，松三糖, 麥芽三糖 和蜜三糖。更換裝載不同離子（Ca2+, Pb2+, Na+或 H+）的色譜柱進(jìn)樣測定，比較分析各糖組分的色譜行為，糖組分峰形及分離僅有輕微變化，沒有一種色譜柱能夠?qū)⒎涿蹣悠钒蟹N類的二糖與三糖完全分離。綜上所述，本方法選擇Phenomenex Rezek RCM(Ca2+)300×8mm作為蜂蜜中糖組分的色譜分離柱。

2.2 液相色譜-同位素質(zhì)譜法測定精度

在每次樣品測定時均測定蜂蜜質(zhì)控樣品，統(tǒng)計3個月內(nèi)，測定65個不同日期獲得質(zhì)控樣品各糖組分的δ13C值，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定結(jié)果見表1。

按照前述方法測定，果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1～0.5‰。在表1看出，二糖和三糖標(biāo)準(zhǔn)偏差比果糖、葡萄糖稍微高一些，是由于它們在蜂蜜中含量相當(dāng)?shù)颓易鳛榭偡鍦y定，同時諸如LC系統(tǒng)、色譜分離、化學(xué)氧化、CO2氣體分離單元等因素也存在造成偏差增大的可能性。對于日常蜂蜜分析，表1中標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)說明，LCIRMS法完全可以滿足蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值測定要求。

2.3 純正蜂蜜各組分Δδ13C值分布區(qū)間的確定

應(yīng)用元素分析-同位素質(zhì)譜法（EA-IRMS）與液相色譜-同位素質(zhì)譜法（LC-IRMS）相結(jié)合，對采自全國26個省及地區(qū)、20個不同蜜種385個純正蜂蜜樣品中蜂蜜、蛋白質(zhì)及各糖組分δ13C值進(jìn)行檢測，測定結(jié)果見表2。從表2看出，各種純正蜂蜜樣品，在蜂蜜、蛋白質(zhì)、果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值的平均值之間有較小差異，見表3。蜂蜜中各組分δ13C值標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過1‰，應(yīng)用各組分δ13C值的差值(Δδ13C 值)檢測蜂蜜摻假是適合的。

表1 LC-IRMS法在3個月內(nèi)測定質(zhì)控樣品重現(xiàn)性數(shù)據(jù)（n=65）

表2 EA/LC-IRMS法純正蜂蜜的測定結(jié)果（n=385）

表3 表2中純正蜂蜜樣品δ13C值的差值(Δδ13C 值)（n=385）

385個純正蜂蜜各糖組分Δδ13C測定結(jié)果列于表3，從表2、3可以看出，所有的Δδ13C的平均值低于±1.0‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.7‰。通過大量純正蜂蜜檢測，在任何情況下，獲得的最大差值不超過2.1‰，因此，在檢測大量不同地區(qū)、不同蜜種的純正蜂蜜基礎(chǔ)上，獲得我國純正蜂蜜各組分Δδ13C分布區(qū)間同時滿足：Δδ13Cfru–glu=±1.0‰、Δδ13Cp–h≥–1.0‰、Δδ13Cmax.= ±2.1‰。該結(jié)論與文獻(xiàn)[17]中Elflein研究結(jié)論相符。

2.4 蜂蜜摻假檢測應(yīng)用

應(yīng)用EA/LC-IRMS法和純正蜂蜜各組分Δδ13C分布區(qū)間，在2010年2月至2011年5月對243個（委托樣品）懷疑使用糖漿摻假的蜂蜜樣品完成檢測。利用已有的EA-IRMS法，測定蜂蜜和蛋白質(zhì)的δ13C值，計算C-4植物糖含量，C-4植物糖不合格的樣品11個，檢測摻假只有4.5%。利用EA/LCIRMS法檢測，檢測結(jié)果按照純正蜂蜜判定準(zhǔn)則進(jìn)行判定時，85個樣品不合格，檢測摻假達(dá)到35%，本方法蜂蜜摻假檢出率遠(yuǎn)高于原來方法。

2009年9月至2011年9月，應(yīng)用本方法為全國87家蜂產(chǎn)品加工與出口單位檢測蜂蜜樣品1500多個批次，對檢測結(jié)果均未提出異議，也未出現(xiàn)由于檢測結(jié)果不準(zhǔn)導(dǎo)致國外退賠現(xiàn)象，有效促進(jìn)了蜂蜜出口。

3 結(jié)論

利用該方法對我國26個省及地區(qū)、20個不同蜜種385個純正蜂蜜樣品中蜂蜜、蛋白質(zhì)及各糖組分δ13C值進(jìn)行檢測，通過統(tǒng)計分析，確定了我國純正蜂蜜Δδ13C值分布區(qū)間，為提高我國蜂產(chǎn)品質(zhì)量，鑒別蜂蜜摻假提供了技術(shù)手段。

[1]GB 18796-2005.Honey.National Standards of the People’s Republic of China (蜂蜜:國家標(biāo)準(zhǔn)).

[2]Doner L W,White J W,Phillips J G.J.Assoc.Off.Anal.Chem.,1979,63(1): 186.

[3]Kushnir I.J.Assoc.Off.Anal[J].Chem,1979., 62 (4): 917.

[4]White J W.J.Assoc.Off.Anal[J].Chem,1980,63 (1): 7.

[5]Kim H J, Richardson M J.Chromatogr.1992, 593: 153.

[6]Ruiz-Matute A I , Soria A C, Martínez-Castro I, Sanz M L.J.Agric[J].Food Chem,2007,55(18):7264-9.

[7]Cotte J F, Casabianca H, Lhéritier J, Perrucchietti C, Sanglar C,Waton H, Grenier-Loustalot M F.Anal chim acta.2007,582(1):125-36.

[8]Bertelli D, Lolli M, Papotti G, Bortolotti L, Serra G, Plessi M J.Agric[J].Food Chem,2010,58(15):8495-501.

[9]Kelly J D, Petisco C, Downey G.J.Agric[J].Food Chem,2006,54(17):6166-71.

[10]Cotte J F, Casabianca H, Chardon S, Lheritier J, Grenier-Loustalot M F.J.Chromatogr.A.2003,1021(1-2):145-55.

[11]Cordella C, Antinelli J F, Aurieres C, Faucon J P, Cabrol-Bass D,Sbirrazzuoli N.J.Agric[J].Food Chem.2002 ,50(1):203-8.

[12]Mishra S, Kamboj U, Kaur H, Kapur P.Int.J.Food Sci[J].Nutr,2010,61(3):306-15.

[13]Cotte J F, Casabianca H, Giroud B, Albert M, Lheritier J,Grenier-Loustalot M F.Anal.Bioanal.Chem.2004 ,378(5):1342-50.

[14]White, J.W.Winters, K.J.Assoc.Off.Anal.Chem.72 (4),907.1989.

[15]Kropf U, Golob T, Ne?emer M, Kump P, Koro?ec M, Bertoncelj J,Ogrinc N.J.Agric.Food Chem.2010,58(24):12794-803.

[16]Caba?ero A I, Recio J L, Rupérez M.J.Agric.Food Chem.54(26):9719-27.2006.

[17]Elflein L, Raezke K P.Apidologie, 2008,39(5): 574.