蘇松坤 汪理想, 潘 嬌 劉 芳 陳大福 戴雙進(jìn) 陳盛祿

（1 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

隨著社會(huì)的進(jìn)步，蜜蜂對(duì)人類(lèi)的價(jià)值越來(lái)越被重視，其授粉作用的不可替代性及相應(yīng)蜂產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展，病蟲(chóng)害一直是威脅養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的最大問(wèn)題。利用抗生素等化學(xué)藥品在一定程度上控制住疾病，但長(zhǎng)期使用卻削弱了蜜蜂的抵抗力，增強(qiáng)病原的耐藥性，迫使人們不得不加大使用劑量，如此形成惡性循環(huán)，危害了環(huán)境也造成蜂產(chǎn)品藥物殘留。隨著人們對(duì)食品質(zhì)量要求的不斷提高及環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，不使用殺蟲(chóng)劑和抗生素的自然態(tài)抵御蜜蜂病蟲(chóng)害的方法越來(lái)越受到人們重視。

蜜蜂的衛(wèi)生行為指其能夠檢查、咬開(kāi)封蓋房并清除已染病害的蜜蜂蟲(chóng)蛹。已有的衛(wèi)生行為測(cè)試即是通過(guò)檢測(cè)蜂群對(duì)冷凍致死封蓋子的清除能力，來(lái)評(píng)估蜂群對(duì)染病封蓋子的清除能力[1]。早年美國(guó)就開(kāi)始培育抗病和抗螨的蜜蜂品系，他們發(fā)現(xiàn)，清巢能力強(qiáng)的蜜蜂品系很少患美洲幼蟲(chóng)腐臭病或白堊病，蜂螨也少。這類(lèi)蜜蜂品系能發(fā)現(xiàn)并迅速移走患病或被蜂螨感染的幼蟲(chóng)，移除病原體從而限制疾病的傳播。衛(wèi)生行為是一種隱性性狀，只有蜂王和雄蜂均來(lái)自具有衛(wèi)生行為的蜂群時(shí)，后代工蜂才能表現(xiàn)出衛(wèi)生行為。1990年白堊病在江浙一帶發(fā)生后迅速蔓延到全國(guó)各地，嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)，廣大蜂農(nóng)也因此迫切希望能夠選育出既高產(chǎn)又能抗白堊病的蜂種。有研究表明，不同品種、品系的蜜蜂，甚至同一品種、品系內(nèi)的不同蜂群，其抗白堊病能力、工蜂發(fā)現(xiàn)病蟲(chóng)時(shí)間的早、晚及清除病蟲(chóng)的能力等特征都存在著遺傳特性上的差異，而這些特征又都和蜂群的抗白堊病能力密切相關(guān)。

蜜蜂具有衛(wèi)生行為包括兩個(gè)過(guò)程，即打開(kāi)封蓋和移走病蟲(chóng)、死蟲(chóng)或者受傷幼蟲(chóng)。有研究比較了具有衛(wèi)生行為的蜂群和不具有衛(wèi)生行為的蜂群對(duì)針扎致死封蓋子在一個(gè)小時(shí)內(nèi)的死蟲(chóng)被清除量，結(jié)果顯示具有衛(wèi)生行為的蜂群和不具有衛(wèi)生行為的蜂群在清除死蟲(chóng)的數(shù)量上存在極顯著差異（P＜0.01)[2]。

Rothenbuhler提出蜜蜂的衛(wèi)生行為是由基因控制的，u代表打開(kāi)封蓋子，r代表清除不正常幼蟲(chóng)，當(dāng)親本基因?yàn)閡u/rr時(shí)，蜜蜂就同時(shí)具有打開(kāi)封蓋房和清除不正常幼蟲(chóng)的行為[3]。具有衛(wèi)生行為的蜜蜂消除了病菌的感染和減弱了疾病在蜂群的傳播，同時(shí)能夠自我治愈。那些能夠在很短時(shí)間內(nèi)移除死亡封蓋子的蜂群就被認(rèn)為具有衛(wèi)生行為，那些表現(xiàn)出患病特征和在巢脾上有死亡的幼蟲(chóng)則被認(rèn)為不具有衛(wèi)生行為。具有衛(wèi)生行為的蜂群移除死亡幼蟲(chóng)的效率明顯高于不具有衛(wèi)生行為的蜂群，只要經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)倪x擇就有可能獲得具有很高衛(wèi)生行為的蜂群[4,5]。有研究者已論證多種信號(hào)會(huì)誘發(fā)蜜蜂對(duì)死亡幼蟲(chóng)的清理，如嗅覺(jué)探測(cè)、健康幼蟲(chóng)和被感染或死亡幼蟲(chóng)的表面溫度[6,7]。通過(guò)患美洲幼蟲(chóng)腐臭病的蜂群或?qū)Ψ淙鹤⑸溆紫x(chóng)芽孢桿菌來(lái)使蜂群患幼蟲(chóng)腐爛病來(lái)研究蜜蜂的衛(wèi)生行為[8]。此外，有研究證實(shí)氰化物殺死封蓋子幼蟲(chóng)或者針扎致死出現(xiàn)血淋巴，增加蜜蜂清除死亡幼蟲(chóng)的速率，引起了蜜蜂的清理行為[9]。

冰凍致死的封蓋子經(jīng)常被用來(lái)調(diào)查蜂群的衛(wèi)生行為。用液氮使巢脾迅速處于冰凍狀態(tài)，極短時(shí)間內(nèi)殺死封蓋子。殺死封蓋子的方法不同，蜜蜂對(duì)其清除的速率就不同。判斷蜂群的衛(wèi)生行為應(yīng)該將殺死的封蓋子在放入實(shí)驗(yàn)蜂群后不同的時(shí)間段測(cè)驗(yàn)。殺死的封蓋子日齡不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)有所區(qū)別。冰凍致死的封蓋子及時(shí)放回蜂群和過(guò)幾天后再放回蜂群，蜜蜂會(huì)有不同的清除速率，前者會(huì)更快。

研究表明，具有衛(wèi)生行為的蜂群可以抵御多種蜜蜂病蟲(chóng)害的危害。白堊病是蜂群的常患病害之一，在同一蜂場(chǎng)中可能同時(shí)存在患病群與健康群，健康蜂群對(duì)白堊病有較強(qiáng)的抵抗能力。同時(shí)，由于白堊病對(duì)蜂群的影響很大，因此疾病抵抗能力蜂種的選育就顯得極為重要。本研究在不同的處理?xiàng)l件下，觀察不同蜂群的清理行為，研究清理能力與抵抗白堊病之間的關(guān)系，為判斷蜂群的清理能力及抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

特制的巢礎(chǔ)切塊機(jī)、冰柜、智能恒溫恒濕箱、液氮、大頭針、蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)蜂群

所選蜂場(chǎng)為浙江大學(xué)華家池實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)，五群健康的蜂群及六群群勢(shì)基本一致的蜂群（每箱四脾，其中兩個(gè)為封蓋子脾），其中三群為患白堊病的蜂群，三群為健康的蜂群。

1.3 實(shí)驗(yàn)一：封蓋子脾在不同處理下的死亡情況

將A、B、C、D、E五個(gè)蜂群，每群用特制的巢脾切塊機(jī)切出八塊大小完全一致的6.5*3.5cm的封蓋子塊，分別在經(jīng)水泡2 h、水泡5 h、水泡24 h、-20℃冰凍2 h、-20℃冰凍4 h、針扎、液氮、空白環(huán)境處理后，放在一個(gè)有透氣的小紙箱里面，然后把所有的小封蓋子脾放在34.5℃、70%濕度的智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱里面，每隔一天（24 h）觀察記錄一次封蓋子的出房情況，連續(xù)觀察12 天。

表1 不同條件處理下封蓋子脾的出房率

1.4 實(shí)驗(yàn)二：白堊病患群與健康蜂群清理能力檢測(cè)

三群患白堊病蜂群和三群健康蜂群，在保證群勢(shì)基本一致的情況下每群用特制的巢脾切塊機(jī)切出四塊6.5×3.5 cm的小封蓋子脾，分別在經(jīng)水泡24 h、-20℃冰凍24 h、液氮、針扎處理后，放回原群，每隔24 h觀察記錄一次封蓋子的剩余數(shù)目。連續(xù)觀察三次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

t檢驗(yàn)用來(lái)統(tǒng)計(jì)分析不同處理方法的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)一結(jié)果

試驗(yàn)一的結(jié)果表明，分別經(jīng)水泡24 h、-20℃冰凍2 h、-20℃冰凍4 h、液氮冷凍和針扎處理后，所有封蓋子均未能成功出房，而水泡2 h、水泡5 h和空白處理組均有蜜蜂出房，詳見(jiàn)表1。

從表1可以看出，空白對(duì)照組的封蓋子出房率最高，但也僅僅剛過(guò)半數(shù)；水泡2h和水泡5h處理后的封蓋子出房率之間不存在顯著差異（P=0.86＞0.05）但是其出房率均顯著低于空白對(duì)照組，當(dāng)水泡時(shí)間延長(zhǎng)到24h時(shí)，封蓋子全部死亡（即出房率為零）；此外，三種-20℃冰凍條件（2 h, 4 h, 24 h）、液氮冷凍及針扎處理后的封蓋子出房率均為零。由此得知，水泡24h及以上、冰凍、液氮冷凍、針扎等處理方法均可用于后續(xù)的蜂群清理能力檢測(cè)試驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)二結(jié)果

試驗(yàn)二研究的是實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在24h、48h、72h內(nèi)蜜蜂對(duì)實(shí)驗(yàn)封蓋子的清理百分比。其中，分析實(shí)驗(yàn)處理后共三次觀察統(tǒng)計(jì)得到的封蓋子剩余量發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)處理后24h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)與對(duì)照蜂群對(duì)經(jīng)水泡處理的封蓋子清理能力才存在顯著差異，對(duì)冰凍處理后后的封蓋子清理能力呈差異極顯著，而對(duì)液氮和針扎處理的封蓋子并無(wú)顯著差異（見(jiàn)圖1）；處理后48h及72h內(nèi)，蜂群只對(duì)經(jīng)水泡24h處理的封蓋子清理能力存在顯著差異，對(duì)其他三種處理后的封蓋子清除效果無(wú)顯著差異（見(jiàn)圖2，3）。

圖1 24h內(nèi)不同方法對(duì)幼蟲(chóng)的清除率

圖2 48h內(nèi)蜜蜂對(duì)幼蟲(chóng)的清除率

圖3 72h內(nèi)蜜蜂對(duì)幼蟲(chóng)的清除率

由以上三個(gè)圖可以得知，采用水泡24h或冰凍24h處理封蓋子脾并在24h或48小時(shí)內(nèi)統(tǒng)計(jì)蜜蜂對(duì)幼蟲(chóng)的清除率的方法可以篩選具有衛(wèi)生行為的蜂群，并用于培育具有抗白堊病性狀的新蜂種。

3 討論

試驗(yàn)一保證了使用二中所有的處理結(jié)果都是一樣，那就是封蓋子幼蟲(chóng)的死亡。試驗(yàn)二的結(jié)果顯示，蜜蜂對(duì)經(jīng)過(guò)針扎致死的幼蟲(chóng)清理速率明顯高于其它組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果差異不顯著，利用針扎處理不能很好的判斷蜂群的衛(wèi)生行為。

根據(jù) Büchler 的研究結(jié)果，蜜蜂在17.3 h內(nèi)移除50%的針扎致死的封蓋子。而我們的試驗(yàn)顯示，蜜蜂在24h內(nèi)移除了94%的針扎致死的封蓋子幼蟲(chóng)，說(shuō)明不同蜂群的衛(wèi)生行為存在差異。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，蜜蜂對(duì)針扎致死幼蟲(chóng)的清理速率明顯高于液氮組、水泡組和冰凍組。

本試驗(yàn)表明，水泡組在48 h內(nèi)都存在差異，冰凍組在24小時(shí)內(nèi)存在顯著差異，說(shuō)明利用水泡24和冰凍的方法能夠很好的凸顯蜂群的清理行為，其他學(xué)者也認(rèn)為冰凍實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝芎玫蔫b定蜂群的衛(wèi)生行為[10]。Spivak and Gilliam[11]和 Spivak and Reuter[1]曾用液氮處理實(shí)驗(yàn)封蓋子脾，能夠直接把封蓋子殺死，液氮組在三個(gè)時(shí)間段內(nèi)都沒(méi)有顯著性的差異，相關(guān)的問(wèn)題還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，蜂群對(duì)經(jīng)過(guò)液氮處理的封蓋子清理速度比針扎組慢，但經(jīng)過(guò)72 h后基本完全清理。

利用水泡24 h的條件處理，在實(shí)際生產(chǎn)中更為方便，在實(shí)驗(yàn)上冰凍和水泡都能達(dá)到很好的效果，能判斷蜂群的衛(wèi)生行為；但在實(shí)際生產(chǎn)中，利用水泡處理能夠隨時(shí)隨地進(jìn)行，且差異顯著持續(xù)的周期長(zhǎng)（48 h），冰凍組為24 h。利用此方法，在抗病育種上我們能夠快速簡(jiǎn)便的選擇出清理能力強(qiáng)的抗病蜂群。

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