曾文興 蘇 虹 王美珍 劉玉琳 王福財 胡有長 江麗霞 施橋發(fā) (南昌大學醫(yī)學院，南昌330006)

乙型肝炎是乙型肝炎病毒(HBV)感染引起最常見的全球性肝臟疾病[1]。據(jù)估計，全世界有20億人已感染乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.6億存在慢性感染、肝硬化、肝癌或并發(fā)其他嚴重疾病或死亡的風險。幾十年來以明礬為佐劑的乙肝疫苗接種在防治乙肝病毒感染中發(fā)揮了重要作用。但有報道稱在一些尿毒癥和其他免疫缺陷疾病等免疫功能抑制患者中，由于保護性機制存在不足，導致鋁佐劑的佐劑作用效應不明顯，不能誘導有效的保護性免疫應答，使疫苗接種成功率降低[2]。因此，科學界一直在努力尋找更有效的疫苗佐劑來增強乙肝疫苗免疫效果。

防御素是一類富含半胱氨酸的內(nèi)源性抗菌肽，它的分子結構穩(wěn)定且具有廣泛的抗細菌、真菌和部分病毒的作用[3-8]。按照分子結構特征及來源不同，動物防御素可分為 α-防御素、β-防御素和 θ-防御素 3 種[9，10]。最近研究表明，防御素-2(BD2)是防御素家族的重要成員，被認為是聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的橋梁。許多研究都表明人β-防御素2具有細胞趨化的活性[11，12]，通過 CCR6趨化記憶 T細胞和未成熟樹突狀細胞，并可以促進樹突狀細胞成熟[13-16]，加強抗原遞呈作用，從而加強機體免疫應答。本研究中我們采用含 HBD2基因的質(zhì)粒pEGF-C1/HBD2聯(lián)合乙肝疫苗免疫小鼠，觀察HBD2增強乙肝疫苗免疫效果的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑 BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡，每只18～22克，SPF級)，華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供;CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PerCP，購自BD公司;重組乙型肝炎疫苗，每支1.0 ml(20 μg/ml)，北京天壇生物制品股份有限公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒購自天根生物技術公司。乙肝表面抗體診斷試劑盒購自英科新創(chuàng)科技有限公司。

1.1.2 儀器 酶標儀(model 3550，Biorad公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Napco公司，法國);ELX-800型流式細胞儀(BD公司，美國);低溫離心機(科大創(chuàng)新KDC-2046)。

1.2 方法

1.2.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提 抽提步驟參照天根公司試劑盒操作手冊進行質(zhì)粒抽提。其主要步驟如下:收集菌液，離心并收集細菌沉淀;加入溶液P1重懸細菌，加入溶液P2，室溫放置5分鐘，加入溶液P3，立即混勻，室溫放置5分鐘后離心，將離心后得到的上清液加入到吸附柱AC中離心，棄廢液;向AC柱中加入E-WB，離心棄廢液，加入洗液WB，離心棄廢液，取出吸附柱AC，放到一個干凈離心管中，在吸附膜中加入EB緩沖液將其重新溶解后離心收集濾液。通過分光光度計測量質(zhì)粒的OD值，計算純度和濃度。

1.2.2 實驗動物和免疫接種及采血 4～6周齡BALB/c小鼠隨機分成4組，每組10只，在小鼠股四頭肌注射小鼠，分別在第二周和第四周加強免疫1次。小鼠分組及免疫計量如下:第一組:PBS組免疫PBS 200 μl，第二組免疫2 μg乙肝疫苗，第三組將2 μg乙肝疫苗聯(lián)合100 μg pEGF-C1質(zhì)?；旌虾竺庖?，第四組:100 μg pEGF-C1/HBD2質(zhì)粒聯(lián)合2 μg乙肝疫苗混合后免疫，保證每只免疫小鼠200 μl等體積，在第三次免疫后兩周眼眶采血，離心收集血清。

1.2.3 小鼠血清乙肝表面抗體檢測 用ELISA檢測試劑盒通過酶標儀檢測小鼠血清中總乙肝表面抗體OD值:在預包被的96孔板中分別加入稀釋的血清50 μl;另設一組空白對照。然后加入酶標試劑50 μl，混勻，37℃溫育1小時;洗滌6次，每孔加入顯色劑A、B各50 μl;輕輕振蕩，37℃避光顯色20分鐘;每孔加入終止液50 μl，混勻，酶標儀檢測450 nm處OD值。

1.2.4 淋巴細胞增殖試驗 免疫后的小鼠脾臟制備成單個細胞懸液，用10%小牛血清含雙抗1640調(diào)整細胞濃度為2×106ml-1，取96孔板，每孔加入100 μl細胞懸液，分別加入刺激物 ConA 5 μg/ml，乙肝疫苗0.2 μg/ml和1640作為控制組。一式三份，每孔終體積為200 μl，另設調(diào)零孔。培養(yǎng)板放于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時，在結束前4小時，每孔加入20 μl CCK8繼續(xù)培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)結束后，用酶標儀檢測每孔A450OD值。

1.2.5 脾細胞指數(shù)檢測 第三次免疫后兩周，稱量小鼠體重，頸椎脫臼處死小鼠，無菌取脾臟，并稱各小鼠脾重，按公式計算脾臟指數(shù)。

1.2.6 流式細胞術檢測CD3+/CD4+T細胞與CD3+/CD8+T細胞數(shù)值與比例 將脾制成單個細胞懸液后用PBS調(diào)整細胞濃度，將購買的熒光抗體CD3∶CD8∶CD4=2∶2∶1 體積比例混合后，按每 100 μl單個核細胞懸液(濃度107個/ml)中加入10 μl混合抗體，充分混勻后，室溫避光孵育30分鐘。用PBS 300 μl重懸，經(jīng)流式細胞儀檢測，以不加抗體的細胞為背景對照，以CD3分子設門，進一步檢測CD4+和CD8+T淋巴細胞百分率。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19軟件進行處理。檢驗前各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)轉換成為正態(tài)分布數(shù)據(jù)后再進行方差分析，對方差分析結果有統(tǒng)計學意義的各組采用SNK法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人β-防御素2對小鼠HBsAb的影響 采用雙抗原夾心ELISA法對免疫三次后各組小鼠血清中HBsAb水平進行檢測，結果顯示乙肝疫苗聯(lián)合pEGF-C1/HBD2質(zhì)粒免疫組抗體水平最高，且明顯高于乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1質(zhì)粒免疫組和PBS對照組(P＜0.05)，但與乙肝疫苗組相比增高不明顯(P＞0.05)，說明人β-防御素2可能具有增強小鼠對乙肝疫苗體液免疫應答的功能。結果見表1、圖1。

2.2 細胞體外增殖反應 采用CCK8試劑盒通過酶標儀檢測OD450值，觀察各實驗組細胞增殖情況。結果在分別以PBS、ConA和HBsAg等3種不同物質(zhì)為體外試驗刺激物的試驗中，均觀察到乙肝疫苗聯(lián)合pEGF-C1/HBD2免疫組小鼠脾淋巴細胞增殖能力比其它免疫組小鼠明顯增強(P＜0.05)，且乙肝疫苗免疫組小鼠脾淋巴細胞增殖能力比PBS組和乙肝疫苗聯(lián)合pEGF-C1免疫組強(P＜0.05)。在同一免疫組內(nèi)，不同體外刺激物作用下的各個小組之間，ConA與乙肝疫苗對細胞的刺激增殖作用都比Control強(P＜0.05)，結果見表2。

表1 不同免疫組小鼠血清HBsAb OD450值(±s，n=5)Tab．1 OD450 values of the mouse serum HBsAb(±s，n=5)

表1 不同免疫組小鼠血清HBsAb OD450值(±s，n=5)Tab．1 OD450 values of the mouse serum HBsAb(±s，n=5)

Note:A，B，C and D indicate the mice groups immunized with PBS，HB-sAg vaccine，HBsAg vaccine combined with pEGF-C1 and HBsAg vaccine combined with pEGF-C1/HBD2，respectively.1)P ＜0.05，group D is compared with group A and C;2)P ＞0.05，group D is compared with group B.

Group OD450value PBS(A)0.006±0.001 HBsAg(B) 1.422 2±0.568 HBsAg combined pEGF-C1(C) 1.109±0.211 HBsAg combined pEGF-C1/HBD2(D) 1.765 3±0.586 1)2)

圖1 各免疫組小鼠血清總HBsAb OD450值Fig．1 OD450 values of the mouse serum total HBsAb

表2 不同免疫組小鼠脾淋巴細胞體外刺激增殖效應(OD450，±s，n=5)Tab．2 The proliferation effective of the spleen lymphocytes from various groups(OD450，±s，n=5)

表2 不同免疫組小鼠脾淋巴細胞體外刺激增殖效應(OD450，±s，n=5)Tab．2 The proliferation effective of the spleen lymphocytes from various groups(OD450，±s，n=5)

Note:1)Compared with other groups stimulated with PBS in vitro，P ＜0.05;2)Compared with other groups stimulated with ConA in vitro，P ＜0.05;3)Compared with other groups stimulated with HBsAg in vitro，P ＜0.05;4)Compared with other stimulating groups in vitro immunized with HBsAg invivo，P ＜0.05;5)Compared with other stimulating groups in vitro immunized with HBsAg combined pEGF-C1 in vivo，P ＜0.05;6)Compared with other stimulating groups in vitro immunized with HBsAg combined PEGF-C1/HBD2，P＜0.05.

Immunized groups in vivo Stimulating groups in vitro PBS ConA HBsAg PBS HBsAg HBsAg combined pEGF-C1 HBsAg combined pEGF-C1/HBD2 0.32±0.01 0.37±0.01 0.30±0.01 0.64±0.011)0.34±0.01 0.39±0.01 0.36±0.02 0.54±0.052)0.37±0.01 0.42±0.014)0.38±0.035)0.79±0.033)6)

表3 各組之間小鼠脾淋巴細胞中CD3+CD4+T細胞及CD3+CD8+T細胞的比較(±s，n=8)Tab．3 The percents of the CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in the spleen lymphocytes from various groups(±s，n=8)

表3 各組之間小鼠脾淋巴細胞中CD3+CD4+T細胞及CD3+CD8+T細胞的比較(±s，n=8)Tab．3 The percents of the CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in the spleen lymphocytes from various groups(±s，n=8)

Note:1)P ＜0.05，for the value of the percent of CD3 and CD4 double positive T cell，compared with other 3 groups;2)P ＜0.05，for the value of the percent of CD3 and CD8 double positive T cell，compared with other 3 groups;3)P ＜0.05，for the value of the percent of CD3 and CD8 double positive T cell，compared with PBS group;4)P ＜0.05，for the value of CD4+/CD8+T cell，compared with other 3 groups;5)P ＜0.05，for the value of the percent of CD4 and CD8 double positive T cell，compared with HBsAg group.

Groups CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD4+/CD8+PBS 14.94±6.62 27.00±4.71 0.577±0.27 HBsAg 12.69±3.47 38.70±5.502) 0.33±0.11 HBsAg combined pEGF-C1 12.31±1.54 19.49±5.453) 0.66±0.175)HBsAg combined pEGF-C1/HBD2 23.20±2.191) 23.02±2.10 1.01±0.014)

圖2 流式分析各免疫組小鼠脾臟CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞百分率Fig．2 The percents of the CD3+CD4+T cells and CD3+CD8+T cells in the spleen lymphocytes from various groups

2.3 各免疫組小鼠T細胞功能亞群檢測 經(jīng)流式細胞術檢測表明，與其他組相比，乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫組CD4+T細胞百分率明顯升高(P＜0.05)，而乙肝疫苗免疫組和乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組與PBS組相比，CD4+T細胞百分率均有輕微下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CD8+T細胞百分率在乙肝疫苗免疫組百分率最高，與其他相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫組+T細胞百分率比乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組更高，但兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組+T細胞百分率比PBS組明顯下降(P＜0.05)。乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫組CD4+/CD8+T細胞比值顯著提高，與其他組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫組比乙肝疫苗免疫組也有顯著升高(P＜0.05)，但與PBS組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05 )，結果見表3、圖2。

表4 各種免疫組小鼠脾臟指數(shù)(±s，n=5)Tab．4 The spleen index of the mice immunized(±s，n=5)

表4 各種免疫組小鼠脾臟指數(shù)(±s，n=5)Tab．4 The spleen index of the mice immunized(±s，n=5)

Note:1)P＞0.05，compared with other 3 groups.

Groups Spleen index(mg/g)PBS 8.22±0.20 HBsAg 8.30±0.15 HBsAg and pEGF-C1 8.61±0.18 HBsAg and pEGF-C1/HBD21)8.32±0.23

2.4 脾臟指數(shù) 通過對各免疫組小鼠的體重和脾臟重量進行方差分析，結果表明各免疫組小鼠脾細胞指數(shù)差異沒有顯著意義(P＞0.05)，結果見表4。

3 討論

近年來，以明礬為佐劑的乙肝疫苗用于預防接種和防止乙肝病毒感染中發(fā)揮了重要作用。但有相關報道在一部分人群中不會誘導特異性抗體生成，且明礬不輔助細胞免疫反應，因此科研人員一直在努力尋找更有效的疫苗佐劑來增強疫苗的免疫效應。有些試驗也取得了一定的成果，但是仍然有一定局限性。

在本研究中，通過對各免疫組小鼠血清乙肝表面抗體水平進行比較，發(fā)現(xiàn)含有HBD2基因的質(zhì)粒免疫后，小鼠產(chǎn)生的血清抗體比單獨乙肝疫苗免疫產(chǎn)生的抗體含量明顯增加，因此人-β防御素2能夠提高機體對乙肝疫苗產(chǎn)生的體液免疫反應，從而提高保護抗體水平，更好的預防HBV感染。

一些研究者已經(jīng)證明通過促進抗原遞呈細胞對抗原的攝取、加工和遞呈，可使更多的抗原被給予組織相容性抗原相關的輔助性T細胞，刺激T細胞增殖和分化[17]。本文研究了以HBD2為佐劑的乙肝疫苗免疫小鼠脾細胞的體外增殖效應，發(fā)現(xiàn)用乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2質(zhì)粒免疫組小鼠脾淋巴細胞表現(xiàn)出比其他組更高水平的淋巴細胞增殖反應。這種情況可能與人-β防御素2在小鼠體內(nèi)促進了樹突狀細胞趨化與成熟，增強了外源性抗原遞呈，激活了更多的CD4+T細胞，顯著提高了CD4+T的百分率或者其活性有關。有研究認為Al(OH)3作為佐劑，可能具有雙重效應，在小劑量時，對細胞增殖有促進作用，而在大劑量時會產(chǎn)生免疫抑制效應。本研究還發(fā)現(xiàn)，小劑量乙肝疫苗在體外可以較好地刺激T細胞增殖，其效應甚至比ConA更強，表明乙肝疫苗可以有效刺激免疫細胞增殖，產(chǎn)生較好免疫效應，但這種效應是否與作為佐劑的Al(OH)3有關，還需要更多實驗證實。

宿主的免疫功能特別是細胞免疫功能對 HBV感染后的臨床轉歸有重要作用[18-20]。國內(nèi)外研究初步表明，慢性乙型肝炎患者體內(nèi)細胞免疫功能不足，T淋巴細胞亞群失衡，使機體不能有效清除入侵的乙肝病毒，導致疾病的慢性化[21-23]。而本研究發(fā)現(xiàn)HBD2可能存在提高乙肝疫苗細胞免疫功能的作用，從而可能更好地防治HBV感染。

機體正常免疫功能是由各種淋巴細胞亞群間的相互作用來維持的，T淋巴細胞亞群中的CD4+T和CD8+T細胞能夠調(diào)節(jié)其他免疫細胞活性，參與細胞和體液免疫反應。其中CD3/CD4雙陽性輔助性T細胞其主要功能是輔助誘導其他免疫細胞增殖和分化，調(diào)節(jié)免疫功能。而CD3/CD8雙陽性細胞群體，可特異性殺傷靶細胞，具有抗病毒、抗腫瘤和重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過流式細胞儀檢測、比較了不同免疫組小鼠中脾細胞表面分子CD4+T和CD8+T細胞百分率及CD4+/CD8+比值，發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，乙肝疫苗對小鼠CD4+T細胞無明顯激活促進效應，但對小鼠CD8+T細胞具有明顯的激活作用。而乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫小鼠后，與PBS對照組相比CD4+T細胞和CD8+T細胞百分率都表現(xiàn)為一定程度的下降，并且后者下降程度有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為對乙肝疫苗細胞免疫效應具有一定抑制作用。乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1/HBD2免疫小鼠后，對CD4+T細胞百分率比單獨使用乙肝疫苗的免疫組和乙肝疫苗聯(lián)合pEGFP-C1免疫均有更好的激活作用，但對CD8+T細胞百分率沒有顯著提高作用。表明pEGFP-C1/HBD2質(zhì)粒免疫可以在一定程度上提高乙肝疫苗免疫小鼠CD4+T和CD8+T淋巴細胞的數(shù)量和比例，對免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人-β防御素2對乙肝疫苗在小鼠中的免疫功能有一定增強作用，尤其是CD4+T淋巴細胞帶來的Th細胞效應更為明顯。因此HBD2可能具有一定的增強乙肝疫苗免疫保護作用的佐劑效應。本研究對探討適用于增強乙肝疫苗免疫效應的新型免疫佐劑有重要意義。

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