郭俊成 車(chē)秀英 朱壯彥 劉潤(rùn)花 趙富璽 (山西大同大學(xué)免疫學(xué)研究所，大同037009)

E-鈣粘素(E-cadherin)是介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-基質(zhì)間粘附作用的細(xì)胞因子，在胚泡植入與滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)過(guò)程中起重要作用[1]。最近發(fā)現(xiàn)，HPV16 可以抑制 E-cadherin 基因的轉(zhuǎn)錄[2]，還能對(duì)體外培養(yǎng)的絨毛癌BeWo細(xì)胞的遷移、粘附產(chǎn)生負(fù)面影響[3]，而關(guān)于人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HPV感染與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性的報(bào)道目前相對(duì)較少。因此，本研究通過(guò)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者妊娠早期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，以及HPV的感染狀況進(jìn)行檢測(cè)，以探討HPV感染與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2007年8月至2010年6月在我市各大醫(yī)院婦科門(mén)診就診的早期妊娠的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者34例，在排除子宮畸形、宮內(nèi)(細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)等)感染、內(nèi)分泌及夫婦染色體異常，以及既往無(wú)自身免疫性疾病史后作為實(shí)驗(yàn)組?；颊吣挲g22 ～41歲(30.4±5.2)歲，孕期38 ～90天，孕次2～5次，流產(chǎn)次數(shù)2～4次;選取同期正常早孕行人工流產(chǎn)患者41例為對(duì)照組，年齡21～44歲(28.1±6.3)歲，對(duì)照組無(wú)不孕、自然流產(chǎn)、死胎等不良孕產(chǎn)史。兩組患者年齡、孕周、停經(jīng)天數(shù)無(wú)顯著性差異。

1.2 標(biāo)本采集 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者在確認(rèn)胚胎停止發(fā)育或難免流產(chǎn)行清宮，以及正常早孕者行人工流產(chǎn)時(shí)，取其絨毛組織，立即置入10%甲醛溶液中固定24小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。

1.3 試劑和方法

1.3.1 E-cadherin免疫組化檢測(cè) 兔抗人E-cadherin單克隆抗體及免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)步驟依照S-P試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。胞膜和/或胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在5%以上記作陽(yáng)性例數(shù)。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為:0～5%(-)，6% ～20%(+)，21% ～50%(++)，51% ～100%(+++)。

1.3.2 HPV-DNA PCR法檢測(cè) 使用美國(guó)ABI 9700 PCR儀進(jìn)行HPV-DNA檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟為①將組織細(xì)胞加入配置好的細(xì)胞消化液以釋放細(xì)胞DNA;②選用HPV L基因區(qū)的共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè);③再選用改進(jìn)的共有引物PGMY09/11對(duì)所有β-globin陽(yáng)性而HPV陰性的標(biāo)本進(jìn)行再次擴(kuò)增[4](表1)，這樣可檢出HPV-6、11、16、18、30、31、33、35、45、51和52。

表1 PGMY，GP5+/6+及Glob-F/R引物序列Tab．1 PGMY，GP5+/6+and Glob-F/R primer sequences

擴(kuò)增體系包括 DNA 模板15 μl，10×Buffer液10 μl，Taq 酶 5 U，引物各 0.1 mmol/L，四種單核苷酸(dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)各 0.2 mmol/L。擴(kuò)增過(guò)程:94℃預(yù)變性5分鐘，設(shè)定30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為 94℃20秒，39℃ (GP5+/GP6+)和 55℃(PGMY 09/11;Glob-F/Glob-R)20秒，72℃ 40秒，最后72℃延伸5分鐘。所有PCR擴(kuò)增過(guò)程均包含HPV陽(yáng)性、陰性對(duì)照以及β-globin基因?qū)φ铡?/p>

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)(包括Fisher確切概率法)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

E-cadherin在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的滋養(yǎng)層細(xì)胞中均有表達(dá)(圖1)，但實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于對(duì)照組(表2)，二者間差異具有顯著性(U=4.445，P＜0.001);滋養(yǎng)層細(xì)胞中HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別檢出10例與4例，分別占29.4%和11.8%，其差異具有顯著性(P=0.039);HPV感染陽(yáng)性的標(biāo)本中，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin的表達(dá)水平也低于對(duì)照組(表3，P=0.015)。

圖1 滋養(yǎng)層細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)(×400)Fig．1 Immunohistochemical expression of E-cadherin(×400)

表2 流產(chǎn)組與正常組滋養(yǎng)層細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)Tab．2 Expressions of E-cadherin in trophoblast of recurrent abortions and normal groups

圖2 HPV DNA電泳結(jié)果Fig．2 The results of HPV DNA detection

表3 E-cadherin在流產(chǎn)組與正常組HPV陽(yáng)性標(biāo)本中的表達(dá)Tab．3 Expressions of E-cadherin in HPV positive cases of recurrent abortion and normal groups

3 討論

E-cadherin是一種分子量為120Ku鈣依賴(lài)性糖蛋白，主要存在于許多細(xì)胞表面與細(xì)胞外基質(zhì)，在介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間粘附及維持組織結(jié)構(gòu)完整性方面起著重要作用。E-cadherin表達(dá)的不足將直接影響細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，以及細(xì)胞骨架的形成，并最終影響組織細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，小鼠E-cadherin基因被敲除后，其胚胎即可停止發(fā)育[6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，早期妊娠復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平明顯低于正常早孕組(表2)，這提示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生可能與滋養(yǎng)細(xì)胞E-cadherin表達(dá)不足所導(dǎo)致的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)能力下降有關(guān)。

絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HPV感染與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是否存在相關(guān)性，目前尚缺乏足夠證據(jù)。早期國(guó)內(nèi)有學(xué)者認(rèn)為，由于HPV非血行傳播，且衣殼蛋白質(zhì)量較大，難于通過(guò)胎盤(pán)屏障，故對(duì)胎兒不構(gòu)成潛在威脅[7]。最近，Weyn等在流產(chǎn)、早產(chǎn)患者及正常妊娠女性的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中均檢出HPV，且認(rèn)為妊娠早期的滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì) HPV 較妊娠中、晚期更為易感[8，9]。本次研究結(jié)果表明，早期妊娠的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛細(xì)胞內(nèi)HPV感染率(29.4%)明顯高于正常早孕組(11.8%)。因此，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞HPV感染很可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)存在相關(guān)性。

目前，關(guān)于HPV感染導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機(jī)制尚不明確。最近，Selma 等[3]通過(guò) HPV16 E5、E6、E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的絨毛癌 BeWo細(xì)胞證實(shí)，HPV16能夠抑制BeWo細(xì)胞的遷移、粘附活性;同時(shí)，HPV16 E5、E6、E7蛋白對(duì) E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的也有抑制作用[2]。在本實(shí)驗(yàn)中，早期妊娠復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛細(xì)胞內(nèi)HPV感染率明顯高于正常早孕組，而且與正常早孕組相比，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組中HPV陽(yáng)性的標(biāo)本更趨向于E-cadherin低水平表達(dá)(表3)。由此推斷，流產(chǎn)組絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞E-cadherin低水平表達(dá)可能與HPV感染有關(guān)。HPV對(duì)E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，導(dǎo)致絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)不足，進(jìn)而影響絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述，可以認(rèn)為，妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞E-cadherin的異常表達(dá)可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)，而HPV可能參與這一過(guò)程。

1 Staun-Ram E，Shalev E.Human trophoblast function during the implantation process[J].Reprod Biol Endoc，2005;56(1):1-12.

2 Samir R，Asplund A，Tot T et al．High-Risk HPV Infection and CIN grade correlates to the expression of c-myc，CD4+，F(xiàn)HIT，E-cadherin，Ki-67，and p16INK4a[J].J Low Genit Tract Dis，2011;15(4):280-286.

3 Selma B，Christine W，Melody V N et al．Effects of HPV-16 E5，E6 and E7 proteins on survival，adhesion，migration and invasion of trophoblastic cells[J].Carcinogenesis，2010;31(3):473-480.

4 Coutlee，F(xiàn)，Rouleau D，Petignat P et al．Enhanced detection and typing of human papillomavirus DNA in anogenital samples with PGMY primers and the Linear Array HPV genotyping test[J].J Clin Microbiol，2006;44(12):1998-2006.

5 潘永正，王 飛，駱 丹.尖銳濕疣組織CD1a、上皮細(xì)胞鈣粘素分子及其mRNA的表達(dá)和朗格漢斯細(xì)胞的電鏡觀察[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009;25(2):152-156.

6 Zhou Y，Genbacev O，F(xiàn)isher S J.The human placenta remodels the uterus by using a combination of molecules that given vasculogenesis or leukocyte extravasation[J].Ann N Y Acad，2003;995(1):73-83.

7 陳曉端，趙承洛，張義龍et al.人乳頭狀瘤病毒感染對(duì)孕婦和絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的影響[J].中華婦產(chǎn)科雜志，1999;34(8):459-461.

8 Weyn C，Thomas D，Jani J et al．Evidence of human papillomavirus in the placenta[J].J Infect Dis，2011;203(3):341-343.

9 Gomez L M，Ma Y，Ho C et al．Placental infection with human papillomavirus is associated with spontaneous preterm delivery [J].Human Reproduction，2008;23(3):709-715.