查兵兵 劉 軍 查 英 王 芳 盛 勵(lì) 丁和遠(yuǎn) 陳灶萍 徐 炯

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海200240)

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞群，它在維持外周免疫耐受、預(yù)防自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用［1-3］。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志［4，5］。近幾年來(lái)，一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始致力于研究 CD4+CD25+T細(xì)胞在Graves病中所發(fā)揮的作用。Saitoh［6］通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在給CD4+CD25+T細(xì)胞基因敲除C57BL/6小鼠注射重組TSH受體后相對(duì)于正常小鼠更容易發(fā)生甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)，這說(shuō)明CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在Graves病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的確起到一定作用，而我們將進(jìn)一步研究它是否在Graves病的治療過(guò)程中存在作用。在臨床實(shí)踐中，131I是Graves病最常用的治療方法，它除了能釋放β射線破壞甲狀腺濾泡上皮減少甲狀腺激素的分泌，也可以抑制甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體［7］，這說(shuō)明131I在Graves病的治療中存在免疫作用機(jī)制。因此，我們將通過(guò)檢測(cè)和比較Graves病患者131I治療前后CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其它淋巴細(xì)胞亞群的變化，驗(yàn)證調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量的變化是否參與131I治療Graves病的免疫作用機(jī)制，并進(jìn)一步探討131I這一治療方案對(duì)Graves病患者免疫應(yīng)答及免疫耐受兩方面的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本課題組自2009年10月至2011年3月在內(nèi)分泌科病房和門診入選受試者。調(diào)查對(duì)象為Graves病患者30例，其中女性19名，男性11名，年齡25～52歲，平均年齡32歲，Graves病患者為通過(guò)甲狀腺指標(biāo)和B超確診的初發(fā)或復(fù)發(fā)患者，患者均入院接受131I治療，患者入組的時(shí)候排除Graves病合并眼病、Graves病應(yīng)用免疫抑制劑、妊娠可能的育齡婦女以及有其它自身免疫性疾病、感染或患有各種惡性腫瘤的患者。

1.2 主要試劑和儀器 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD LSRⅡ);人淋巴細(xì)胞分離液(加拿大，Cedarlane Laboratories);Human Treg Flow Kit試劑盒(Foxp3-APC/CD4-FITC/CD25-PE，美國(guó)，eBioscince);抗 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3－CD19+及 CD3－CD16+CD56+抗體(美國(guó)，BD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色 抽取5 ml靜脈血加入肝素抗凝管，用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞。部分單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3－CD19+及 CD3－CD16+CD56+細(xì)胞數(shù)。取100 μl細(xì)胞懸液(1×106)加入CD4-FITC/CD25-PE雙標(biāo)抗體20 μl，室溫避光染色20分鐘后，用染色緩沖液洗滌1次，加入新配制的固定/透膜液1 ml，室溫暗處孵育20分鐘，離心棄上清，再用染色緩沖液洗滌1次，加1 ml透膜緩沖液室溫避光15分鐘，離心棄上清，加入100 μl透膜緩沖液重懸細(xì)胞，再加入APC標(biāo)記Foxp3抗體5μl，室溫避光孵育30分鐘后，洗滌2次，加入0.5 μl染色緩沖液混勻，用流式細(xì)胞儀收集20 000個(gè)細(xì)胞/管，F(xiàn)lowjo軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，以三色熒光抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率記錄結(jié)果。

1.3.2 Real-Time PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞的Foxp3mRNA 采用Trizol試劑抽提外周血的mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定 OD260/OD280在1.8～2.0 之間，總 RNA 2 μg，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增。每一標(biāo)本取cDNA模板2 μl，F(xiàn)oxp3上下游引物各10 pmol，TaqMan探針5 pmol，GoldTaqDNA聚合酶2.5 μ，最后反應(yīng)總體積為25 μl。在 GeneAmp 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems，USA)軟件分析下得到CT值，經(jīng)內(nèi)參照GAPDH校正，校正值2－△△CT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Foxp3引物:forward:5'-CACCTGGCTGGGAAAATGG-3';reverse:5'-GGAGCCCTTGTCGGATGAT-3'，TaqMan 探針:5'-FAM-ACTGACCAAGGCTTCAT-3'。

1.3.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)甲狀腺功能 游離三碘甲狀腺原氨酸(fT3)(正常值:2.3～4.2 pg/ml)、游離甲狀腺素(fT4)(正常值:0.89 ～1.76 ng/dl)、促甲狀腺素(TSH)(正常值:0.35 ～5.5 μU/ml)、抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)(正常值:0～60 U/ml)及抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)(正常值:0～60 U/ml)(美國(guó)，Siemens Medical Solutions Diagnostics)。

2 結(jié)果

2.1 Graves病患者131I治療前后甲狀腺激素水平Graves病患者經(jīng)過(guò)131I治療前后的甲狀腺激素水平和TPOAb、TgAb檢測(cè)結(jié)果見表1。與治療前比較，Graves病患者經(jīng)過(guò)131I治療后血清fT3和fT4明顯下降，TSH 水平明顯升高(P ＜0.01)，但 TPOAb、TgAb水平并沒有明顯改變。

2.2 Graves病患者131I治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的比例 表2所示，和治療前相比，131I治療后1個(gè)月Graves病患者外周血CD3+CD4+T和CD3－CD19+B細(xì)胞百分率都明顯減少(P ＜0.05)，CD3－CD16+CD56+NK細(xì)胞百分率明顯增加(P＜0.05)，CD3－CD8+T細(xì)胞有增加趨勢(shì)，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3－CD19+、CD3－CD16+CD56+淋巴細(xì)胞亞群的百分率與fT3、fT4、TSH、TGAb及 TPOAb均未顯示明顯相關(guān)性。

2.3 Graves病患者131I治療前后外周血 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率131I治療前及治療后1個(gè)月Graves病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例分別為(1.12±0.60)%和(1.22±0.77)%(圖1)，經(jīng)過(guò)131I治療后Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有增加趨勢(shì)，但差別無(wú)臨床統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率與 fT3、fT4、TSH、TGAb及TPOAb均未顯示相關(guān)性。

表1 Graves病患者131I治療前后甲狀腺功能的變化Tab.1 The thyroid function of Graves'disease before 131I administration and in the first month after 131I administration

表2 Graves病患者131I治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的比例Tab.2 The proportion of peripheral blood lymphocyte subsets in Graves'disease before 131I administration and in the first month after 131I administration

圖1 Graves病患者131I治療前后外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群比例的散點(diǎn)圖Fig.1 The parameter scatter diagram of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells from peripheral blood of Graves'disease patients before 131I administration and in the first month after 131I administration

圖2 Graves病患者131I治療前后外周血中Foxp3mRNA的表達(dá)Fig.2 Foxp3mRNA expression from peripheral blood of Graves'disease patients before 131I administration and in the first month after 131I administration

2.4 Graves病患者131I治療前后外周血中Foxp3mRNA的表達(dá) 我們?cè)趯?duì)外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例的檢測(cè)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Real-Time PCR對(duì)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞特異性標(biāo)志Foxp3基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示131I治療前及治療后1個(gè)月Graves病患者外周血Foxp3mRNA的表達(dá)有增加趨勢(shì)，但差別無(wú)臨床統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

3 討論

Graves病屬于自身免疫性甲狀腺疾病，AITD患者甲狀腺細(xì)胞表面HLA分子以及其他免疫相關(guān)性抗原的異常表達(dá)使其成為抗原遞呈細(xì)胞，在樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞的協(xié)同作用下，激發(fā)和加重T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，造成T淋巴細(xì)胞增殖及B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生促甲狀腺素受體抗體(TRAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)。目前Graves病的治療方案包括131I治療、口服抗甲狀腺藥物和手術(shù)治療，由于131I治療比較方便快捷，仍是Graves病患者中無(wú)131I治療禁忌癥患者的首選治療方案。

為了研究131I對(duì)Graves病的免疫狀態(tài)的影響，劉世娟等［8］動(dòng)態(tài)檢測(cè)并分析了131I治療前及治療后1、3、6、9、12 個(gè)月 Graves病患者免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Graves病患者經(jīng)過(guò)131I治療后CD4+T細(xì)胞有減少趨勢(shì)，而CD8+T細(xì)胞有增加趨勢(shì)，考慮到患者經(jīng)過(guò)131I治療后會(huì)有不同轉(zhuǎn)歸，部分患者需要及時(shí)加用其他口服藥物，為了排除口服藥物可能會(huì)影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量的干擾，我們的試驗(yàn)僅檢測(cè)了治療后1個(gè)月患者的各項(xiàng)免疫指標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)Graves病患者131I治療1個(gè)月后外周血CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3－CD19+B細(xì)胞百分率都明顯減少，因?yàn)镃D19與B細(xì)胞活化和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，而CD4+T細(xì)胞能選擇高親和力B細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞或漿細(xì)胞參與體液免疫應(yīng)答。因此，外周血CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3－CD19+B細(xì)胞含量的減少可以減少患者體內(nèi)過(guò)度的免疫應(yīng)答。另外，131I治療后Graves病患者的CD3－CDl6+CD56+NK細(xì)胞含量有所增加，NK細(xì)胞含量的增加使甲狀腺細(xì)胞內(nèi)漿細(xì)胞分泌的大量自身抗體可以被NK細(xì)胞及時(shí)的清理，從而也控制甲狀腺組織過(guò)度的免疫應(yīng)答。

由于人們對(duì)自身淋巴細(xì)胞亞群的深入認(rèn)識(shí)和進(jìn)一步分類，目前認(rèn)為Graves病患者由于先天性免疫監(jiān)視缺陷，機(jī)體存在免疫耐受障礙，抑制性免疫細(xì)胞功能的減弱導(dǎo)致了T細(xì)胞和B細(xì)胞功能的增強(qiáng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是目前研究最多的具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，是已知的抑制功能最強(qiáng)、抑制譜最廣的一群免疫細(xì)胞，能抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞［9］，錢偉等［10］通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了 Graves 病患者經(jīng)過(guò)口服抗甲狀腺藥物治療前后外周血淋巴細(xì)胞Foxp3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Graves病患者治療前后外周血中 CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量并無(wú)減少，但Foxp3+表達(dá)均顯著降低，而我們研究了Graves病患者經(jīng)過(guò)131I治療前及治療后1個(gè)月外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞及Foxp3mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)131I治療后Graves病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例及Foxp3mRNA的表達(dá)水平有增加趨勢(shì)，但無(wú)臨床統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們推測(cè)131I雖然可以通過(guò)減少CD4+T和B淋巴細(xì)胞的增殖失控和增加NK細(xì)胞的含量來(lái)控制過(guò)度的免疫應(yīng)答，但是不能通過(guò)增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的含量從而改善Graves病患者的免疫耐受障礙。

1 Annacker O，Burlen-Defranoux O，Pimenta-Araujo R et al.Regulatory CD4 T cells control the size of the peripheral activated/memory CD4 T cell compartment［J］.J Immunol，2000;164(7):3573-3580.

2 Miyara M，Sakaguchi S.Natural regulatory T cells:mechanisms of suppression［J］.Trends Mol Med，2007;13(3):108-116.

3 Pan D，Shin Y H，Gopalakrishnan G et al.Regulatory T cells in Graves'disease［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2009;71(4):587-593.

4 Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 ［J］.Science，2003;299(5609):1057-1061.

5 Banham A H，Powrie F M，Suri-Payer E.FOXP3+regulatory T cells:current controversies and future perspectives［J］.Eur J Immunol，2006;36(11):2832-2836.

6 Saitoh O，Nagayama Y.Regulation of Graves'hyperthyroidism with naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells in a mouse model［J］.Endocrinology，2006;147(5):2417-2422.

7 王吉耀，廖二元，胡品津.內(nèi)科學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:887-887.

8 劉世娟，王洪剛，馮永堂et al.131I治療Graves病免疫狀態(tài)變化的規(guī)律及臨床價(jià)值［J］.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005;27(6):410-413.

9 Nagler-Anderson C，Bhan A K，Podolsky D K et al.Control freaks:immune regulatory cells［J］.Nat Immunol，2004;5(2):119-122.

10 錢 偉，張 強(qiáng)，吳漢妮.Foxp3在Graves病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011;27(1):76-78.