夏龍飛 周 紅 胡麗超 陳東東 解鴻翔 王 婷 穆 原

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212013)

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome，APS)是一種以體內(nèi)持續(xù)存在抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody，aPL)、臨床以動靜脈血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)等為主要特征的自身免疫性疾?。?］。本組前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)顯示，β2糖蛋白Ⅰ (beta-2-glycoproteinⅠ，β2GPⅠ)與其相應(yīng)抗體(anti-β2GPⅠ)復(fù)合物(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ)能夠刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)組織因子(Tissue factor，TF)，從而導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面受體AnnexinA2(ANX2)及Toll樣受體4(Tolllike receptor 4，TLR4)作為β2GPⅠ的共受體，能夠介導(dǎo)抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物對細(xì)胞的激活［3-5］。眾所周知，TLR4被其配體激活后，將招募并激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號蛋白，如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，最終導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而引起相關(guān)效應(yīng)［6，7］。核因子 κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，可參與對多種基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控相關(guān)效應(yīng)。近年來有研究顯示NF-κB在TLR4相關(guān)的信號通路中發(fā)揮重要作用。本文主要探討NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)TF表達(dá)過程中是否被激活及其作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人單核細(xì)胞株THP-1(上海中國科學(xué)院細(xì)胞研究所)，RPMI1640(Gibco公司)，超級新生牛血清(Gibco公司)，兔抗人NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65單克隆抗體及兔抗人NF-κB抑制蛋白IκB-α多克隆抗體(Cell signaling公司)，鼠抗人β-actin抗體(Protein tech Group公司)，非特異性同型對照抗體R-IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)，TF活性試劑盒(Assaypro公司)，定量PCR試劑盒(杭州博日科技有限公司)，ECL顯色試劑(GE Healthcare 公司)，LPS(Sigma 公司)，NF-κB抑制劑PDTC、p38抑制劑SB203580(Sigma公司)，ERK1/2抑制劑U0126(Promega公司)，JNK抑制劑SP600125(R＆D公司)，多克隆抗β2GPⅠ抗體和β2GPⅠ(本實驗室制備)，引物(設(shè)計采用primer 5.0，由上海生物工程有限公司合成)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng) 采用 RPMI1640培養(yǎng)液(含10%新生牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部70% ～80%時，細(xì)胞傳代，取傳代3～10次的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 將狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞種入6孔板內(nèi)(2×106/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時后，棄去培養(yǎng)液，換1 ml無血清RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)12小時。根據(jù)需要將細(xì)胞與NF-κB抑制劑PDTC(20 μmol/L)預(yù)先孵育90分鐘，然后根據(jù)實驗設(shè)計加入不同刺激物處理細(xì)胞2小時，收集細(xì)胞，加入1 ml Trizol裂解，混勻后于室溫放置20分鐘充分裂解，按Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系按照試劑盒說明操作，反應(yīng)條件:37℃ 30分鐘，98℃ 5分鐘，4℃ 5分鐘。反應(yīng)所得cDNA用于檢測mRNA表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞裂解物的制備 收集傳代3～10次、狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞，種于6孔板內(nèi)，密度為2×106/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，棄去上清，加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液饑餓12小時后，棄上清，再加1 ml無血清RPMI1640培養(yǎng)基，然后用不同刺激物處理細(xì)胞。抑制試驗時將不同抑制劑(SB203580，10 μmol/L;SP600125，5 μmol/L;U0126，90 nmol/L)與細(xì)胞預(yù)處理30分鐘再加刺激物。收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，于冰上裂解1小時，期間每隔15分鐘劇烈震蕩一次，4℃ 11 200 r/min離心10分鐘后取上清，測定蛋白濃度，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實時定量 PCR(Real time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測 定量PCR分析儀檢測細(xì)胞TF mRNA水平，總反應(yīng)體系為12 μl:其中2×SYBR Mix 6 μl，上下游引物各0.48 μl，最后用滅菌 ddH2O補(bǔ)足至12 μl。TF引物序列為:上游5'-TCAGGTGATCCACCCACCTT-3'，下 游 5'-GCACCCAATTTCCTTCCATTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為211 bp;β-actin引物序列為:上游 5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，下游5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為262 bp。RT-qPCR循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5分鐘;一個循環(huán):95℃ 15 秒，62℃(β-actin、TF)20 秒，72℃20秒;38個循環(huán)擴(kuò)增。目的基因的相對表達(dá)水平=目的基因拷貝數(shù)/β-actin拷貝數(shù)。

1.2.5 Western blot分析 取上述收集的細(xì)胞裂解物標(biāo)本(總蛋白60 μg)與樣本緩沖液作用，94℃變性5分鐘后，12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，再以350 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜;膜置于5%脫脂牛奶的TBS/T室溫封閉1小時;再分別用相應(yīng)的兔抗人NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、IκB-α抗體或鼠抗人β-actin抗體(1∶2 500)4℃孵育過夜;次日用TBS/T洗滌3次，15分鐘/次，采用HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶2 000)或羊抗鼠 IgG(1∶3 000)，37℃孵育 1小時，TBS/T洗滌 3次，15分鐘/次，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，觀察雜交條帶，同時運(yùn)用Champchemi分子成像系統(tǒng)掃描條帶并讀取灰度值。

1.2.6 TF活性檢測 利用TF/Ⅶa復(fù)合物使因子Ⅹ轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨蜃英鷄，根據(jù)Ⅹa生成量來判定細(xì)胞TF的活性。測定標(biāo)本為細(xì)胞裂解物，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。在96孔反應(yīng)板中加入50 μl的樣品稀釋液和10 μl的因子Ⅶ后，分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和測定樣本10 μl，以樣品稀釋液為空白，37℃反應(yīng)30分鐘后，加入因子Ⅹ。37℃反應(yīng)30分鐘后再加入Ⅹa的發(fā)色底物，于405 nm、37℃ 條件下測定吸光度值。吸光度值與樣品中TF活性呈正相關(guān)，TF活性結(jié)果以pmol/L(pmol/L)表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用軟件SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示。對單因素處理組之間數(shù)據(jù)的比較采用One-way ANOVA方法，對雙因素處理組之間數(shù)據(jù)的比較采用Two-way ANOVA方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF mRNA及活性 前期研究發(fā)現(xiàn)抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物能夠誘導(dǎo)血液單核細(xì)胞及單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞表達(dá) TF。本實驗以 R-IgG/β2GPⅠ(同型抗體對照，100 μg/ml)、抗 β2GPⅠ/BSA(同型抗原對照，100 μg/ml)、LPS(陽性對照，500 ng/ml)及抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物(100 μg/ml)分別刺激THP-1細(xì)胞2、6小時后，分別收集細(xì)胞提取總RNA和細(xì)胞裂解物，進(jìn)行了RT-qPCR及TF活性試劑盒分析。如圖1顯示，抗β2GPⅠ/β2GPⅠ 復(fù)合物使TF mRNA表達(dá)水平顯著增加及TF活性明顯增強(qiáng)，與LPS具有相同的刺激效應(yīng)，與空白對照組(media)比較，差異顯著(P＜0.05)，而同型抗體對照R-IgG/β2GPⅠ和抗原對照抗β2GPⅠ/BSA則無此作用。

2.2 抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物促進(jìn) THP-1細(xì)胞NF-κB的活化 為了觀察 NF-κB是否在 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激THP-1細(xì)胞過程中被激活，我們收集刺激不同時間點的細(xì)胞總蛋白，利用相應(yīng)抗體進(jìn)行Western blot分析。由圖2可見，THP-1細(xì)胞經(jīng)anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激后，NF-κB 總蛋白(t-NF-κB p65)水平變化不明顯，但是NF-κB 的磷酸化(p-NF-κB p65)在逐漸增強(qiáng)，并在90分鐘時達(dá)到高峰而后降低;另外，與NF-κB的磷酸化相反，IκB-α蛋白水平隨復(fù)合物作用逐漸下降，于90分鐘達(dá)到最低水平，之后逐漸恢復(fù)。說明抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物作用于細(xì)胞，促進(jìn)了 IκB-α 與 NF-κB(p65/Rel A)解離，后者被激活從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。

2.3 不同刺激物對THP-1細(xì)胞NF-κB p65磷酸化及IκB-α 蛋白的影響 上述結(jié)果表明，anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞內(nèi)NF-κB磷酸化并具有時效性，本實驗進(jìn)一步驗證這一效應(yīng)的特異性。我們采用了不同組合刺激物處理THP-1細(xì)胞90分鐘，收集細(xì)胞提取蛋白標(biāo)本，進(jìn)行Western blot分析，比較各組的刺激效應(yīng)。結(jié)果顯示，同源對照抗體與β2GP Ⅰ組合(R-IgG/β2GP Ⅰ，100 μg/ml)以及無關(guān)抗原對照抗牛血清白蛋白與β2GPⅠ(anti-β2GPⅠ/BSA，100 μg/ml)均不能引起 NF-κB p65的磷酸化以及IκB-α 降解;而抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ (100 μg/ml)能夠明顯增加磷酸化NF-κB p65的表達(dá)(圖3)，與空白對照(media)比較，條帶明顯增強(qiáng)，同時降低IκB-α蛋白含量，條帶弱于對照;LPS(500 ng/ml)作為陽性對照，具有增強(qiáng) NF-κB p65磷酸化并降低 IκB-α含量的效應(yīng)。表明anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞NF-κB p65磷酸化的刺激效應(yīng)具有特異性，結(jié)果與LPS相似。

圖1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)的 THP-1細(xì)胞 TF mRNA(A)表達(dá)及TF活性(B)Fig.1 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ complex induces TF mRNA expression(A)and TF activity(B)in THP-1 cells

圖2 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激 THP-1 細(xì)胞 NF-κB p65的磷酸化及IκB-α變化的時效性Fig.2 Time course of anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced NF-κB p65 phosphorylation and IκB-α change in THP-1 cells

圖3 Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激 THP-1 細(xì)胞 NF-κB p65磷酸化及IκB-α變化的特異性Fig.3 Specific effects of anti-β2GPⅠ/β2GPⅠon NF-κB p65 phosphorylation and IκB-α change in THP-1 cells

2.4 NF-κB 抑制劑 PDTC 對 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF表達(dá)的干預(yù)效應(yīng) 本實驗進(jìn)一步明確了NF-κB抑制劑PDTC是否影響anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF表達(dá)的作用。結(jié)果顯示:PDTC(20 μmol/L)能夠明顯降低 anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激細(xì)胞表達(dá)TF mRNA(圖4A)和TF活性(圖4B)，與PDTC未處理組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而PDTC對無刺激的THP-1細(xì)胞沒有明顯影響(P＞0.05)。本實驗進(jìn)一步表明NF-κB 在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞表達(dá)TF的過程中具有重要的作用。另外，NF-κB抑制劑PDTC也能夠抑制LPS對細(xì)胞TF表達(dá)的刺激效應(yīng)。

2.5 上游信號分子MAPKs的抑制劑對抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NF-κB磷酸化的影響 為明確在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF過程中NF-κB的磷酸化與信號通路中上游關(guān)鍵分子 MAPKs之間的關(guān)系，我們采用了MAPKs抑制劑進(jìn)行試驗。結(jié)果顯示:p38抑制劑SB203580、ERK1/2抑制劑 U0126及 JNK抑制劑SP600125分別單獨(dú)作用細(xì)胞，可使抗β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激細(xì)胞NF-κB磷酸化水平有所降低，與無抑制劑處理組比較，p-NF-κB p65條帶減弱(圖5)，對LPS刺激細(xì)胞NF-κB磷酸化似乎無明顯影響;若同時使用二種抑制劑(SB203580/U0126，U0126/SP600125，SB203580/SP600125)，均可使抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ及LPS引起的NF-κB磷酸化水平明顯降低，條帶顯著減弱(圖5)。三種抑制劑對未刺激的THP-1細(xì)胞基礎(chǔ)NF-κB磷酸化水平無抑制作用(見media組)。

圖4 NF-κB特異性抑制劑PDTC干預(yù)anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞TF mRNA表達(dá)(A)及TF活性(B)Fig.4 The effects of NF-κB inhibitor PDTC on anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced TF mRNA expression(A)and TF activity(B)in THP-1 cells

圖5 MAPKs抑制劑對anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ處理THP-1細(xì)胞對NF-κB活化的影響Fig.5 The effects of MAPKs inhibitors on anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ-induced NF-κB activation in THP-1 cells

3 討論

核因子κB(NF-κB)是從B淋巴細(xì)胞核抽提物中檢測到的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的核蛋白因子，是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子。哺乳動物NF-κB家族包括NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB 和 c-Rel五個成員，除了Rel-B只能與P50或者P52有效的結(jié)合外，存在所有的同源或異源二聚體組合的可能性，并且都具有NF-κB的活性，最常見的二聚體形式是p65/p50異源二聚體。靜息狀態(tài)下NF-κB二聚體與IκB結(jié)合，以無活性形式存在于胞漿。而當(dāng)TNF-α、TLR激動劑等刺激信號作用細(xì)胞時，促使IκB-α磷酸化，然后被泛素結(jié)合酶識別發(fā)生快速泛素化繼而被蛋白酶體蛋白水解。隨著IκB-α的降解，NF-κB二聚體被釋放，進(jìn)而迅速轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與相應(yīng)的κB位點結(jié)合，從而對相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［8］。NF-κB體系主要涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞［9］。

本研究小組前期對抗磷脂綜合征(APS)血栓形成機(jī)制的探討，證明了抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物刺激血液單核細(xì)胞表達(dá)TF是其主要機(jī)制之一。并發(fā)現(xiàn)抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物能夠產(chǎn)生與LPS相同的刺激效應(yīng)，顯著增加單核細(xì)胞株 THP-1表達(dá)TLR4、MD-2及MyD88 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，并且部分依賴ANX2，隨后招募一系列蛋白(包括IRAK1/4、TRAF6及MAPKs)發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，最終促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)TF，從而參與APS血栓形成［10］。本文進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NF-κB在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF過程中被誘導(dǎo)活化，提示NF-κB在其中扮演著重要作用。近年來有文獻(xiàn)報道NF-κB參與了抗磷脂抗體(aPL)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞活化［11，12］，但是關(guān)于 NF-κB 參與抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF鮮有報道。本研究采用不同對照刺激物處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)抗β2GPⅠ/β2GPⅠ對NF-κB的活化具有特異性。

為進(jìn)一步證明 NF-κB在抗 β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF過程中的作用，本研究采用NF-κB特異性抑制劑PDTC以及上游關(guān)鍵信號分子MAPKs特異性抑制劑(p38、ERK及JNK的特異抑制劑SB203580、U0126、SP600125)進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示PDTC能夠抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF的表達(dá)，并且MAPKs特異性抑制劑能夠抑制NF-κB的活化。有文獻(xiàn)報道MAPKs的活化對于抗β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激細(xì)胞表達(dá)相關(guān)因子是必需的，結(jié)合本文結(jié)果，進(jìn)一步表明在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，MAPKs/NF-κB通路至關(guān)重要，提示可作為分子靶點用于防治抗磷脂綜合征的血栓形成［7，8］。

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