朱 娜 李 昌 郭 焱 李 沂 孫丹丹 任靜強(qiáng) 杜壽文 秦艷青 王茂鵬 田宇飛 金寧一

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130122)

細(xì)胞通過模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別病原微生物的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活特定的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，使機(jī)體處于抗感染狀態(tài)。其中最主要的就是誘導(dǎo)干擾素(Interferon，IFN)，特別是Ⅰ型IFN(IFNα/β)的表達(dá)。Ⅰ型IFN通過特異性結(jié)合到病毒感染和非感染細(xì)胞表面的干擾素受體(Interferon receptor，IFNR)，從而誘導(dǎo)數(shù)百個(gè)干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表達(dá)，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答[1]。在ISGs中，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane proteins，IFITMs)是其中較為重要的一種，其表達(dá)后除調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、影響細(xì)胞分化外，還與體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的形成、生殖細(xì)胞的歸巢和成熟、骨鹽的沉積以及抗病毒反應(yīng)等活動(dòng)有關(guān)[2]。

IFITM3是近期發(fā)現(xiàn)的一種具有廣譜抗囊膜病毒活性的蛋白。在人體內(nèi)，IFITM基因家族含有4個(gè)成員，即 IFITM1、IFITM2、IFITM3 和 IFITM5[3]。已經(jīng)證實(shí)IFITM1、IFITM2和IFITM3可以由Ⅰ型或Ⅱ型IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生，它們對(duì)甲型流感病毒的多個(gè)亞型(H1、H3、H5及H7)都有很強(qiáng)的抑制作用，其中IFITM3的抑制效果最強(qiáng)，同時(shí)IFITM3還對(duì)登革熱病毒(Dengue Virus)、西尼羅河病毒(West Nile Virus)、SARS-Co冠狀病毒(SARS Coronavirus)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)等其他不同類型的病毒均有抑制效果[4-6]。缺失IFITM3后IFN的抗病毒反應(yīng)會(huì)明顯變?nèi)?，所以IFITM3在干擾素反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，為人體抗病毒免疫所必需[7]。

為此，我們通過人Ⅰ型 IFN(rhIFNα2B)誘導(dǎo)293T細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行IFITM3的擴(kuò)增，并將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體中，開展其表達(dá)與鑒定的研究，該結(jié)果為進(jìn)一步研究IFITM3基因的功能和生物學(xué)活性以及作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，目前國內(nèi)尚未見相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌種和載體 大腸桿菌E．coli DH5α、人胚胎腎細(xì)胞293T由本實(shí)驗(yàn)室保存;pVAX1載體為Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T simple Vector為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑和儀器 rhIFNα2B干擾素購自Peprotech公司;RIPA裂解液購自Beyotime公司;質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸訟xygen公司;質(zhì)粒制備試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自Hykolong公司;opti-MEM培養(yǎng)液購自Gibco;FuGEENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔源IFITM3 PolyClonal Antibody購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;鼠源Anti-beta-actin Monoclonal Antibody購自聯(lián)科生物;抗熒光猝滅封片液購自碧云天。

英國TECHNE TC512 PCR儀;熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;Thermo Scientific公司的NANODROP 2000 Spectrophotometer;激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 IFITM3基因的擴(kuò)增 人胚胎腎細(xì)胞細(xì)胞系293T細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清及1%青、鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將指數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。第2天將 rhIFN-α2B稀釋液5 μl(濃度1.33×10-5g/ml)加到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，孵育12小時(shí)。TRIzol法提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物:ggggatccgccaccatgaatcacactgtccaaac;下游引物:gggaattcctagtggtggtggtggtggtgtccataggcctggaaga。其中上游引物含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和kozak序列，下游含BamHⅠ酶切位點(diǎn)及his-tag標(biāo)簽，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為:cDNA模板 1 μl，2.5 mol dNTP 2.5 μl，rTaq Buffer 2.5 μl，rTaq 1μl，上、下游引物各1 μl，RNase-free 水16 μl，使反應(yīng)體系終體積為25 μl，離心混勻。PCR程序?yàn)?95℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性 30秒，56℃退火 30秒，72℃延伸 45秒，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10分鐘，4℃保存。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple Vector載體連接，命名為pMD-IFITM3，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切初步鑒定正確后，送往北京華大中天生物公司測(cè)序。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切經(jīng)測(cè)序正確的pMD-IFITM3，凝膠回收目的片段，并與相同酶切的pVAX1相連，命名為pV-IFITM3，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定。

1.5 質(zhì)粒的制備與純化 常規(guī)方法大量制備重組質(zhì)粒pV-IFITM3，詳細(xì)操作步驟參見北京百泰克質(zhì)粒大量制備試劑盒說明書。然后測(cè)定質(zhì)粒濃度及D260/D280值，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，取適量重組質(zhì)粒pV-IFITM3，利用FuGEENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和FuGEENE HD比例為3μg質(zhì)粒和8 μl轉(zhuǎn)染試劑，孵育8小時(shí)，設(shè)載體pVAX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.7 IFITM3的RT-PCR檢測(cè) 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增IFITM3基因，鑒定基因的轉(zhuǎn)錄情況。IFITM3引物及擴(kuò)增方法參照1.3進(jìn)行。

1.8 Western blot檢測(cè)IFITM3在293T細(xì)胞中的表達(dá) 重組質(zhì)粒pV-IFITM3轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，方法同1.6，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時(shí)后，提取細(xì)胞蛋白，取2 μl細(xì)胞蛋白提取液用分光光度計(jì)測(cè)定樣品蛋白含量，測(cè)蛋白濃度 ＞5 mg/ml。取蛋白樣品(600 μg)按4∶1溶于5×loading buffer樣品上樣緩沖液中，混勻，沸水煮沸10分鐘，15%SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至NC(0.45 μm)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，然后分別與5%脫脂奶粉2 000×稀釋的IFITM3抗體4℃孵育12小時(shí)，PBST洗滌3次，每次5分鐘，加入5%脫脂奶粉2 000×稀釋的二抗室溫孵育3小時(shí)，用PBST漂洗3次，每次10分鐘，化學(xué)發(fā)光ECL法顯影檢測(cè)IFITM3表達(dá)，并以β-actin作為內(nèi)參照。

1.9 重組蛋白的激光共聚集檢測(cè) 將指數(shù)生長(zhǎng)的293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孔底附有玻片，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)80% ～90%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，方法同1.6，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到接近長(zhǎng)滿單層時(shí)，取出玻片，用 PBS液沖洗 3次，分析純甲醇(-20℃)固定30分鐘，再用 PBS液洗滌3次，用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，PBS液沖洗3次，每次5分鐘，加入5%脫脂奶粉2 000×稀釋的IFITM3一抗，室溫作用2小時(shí)后，PBS液沖洗3次，加入5%脫脂奶粉200×稀釋的FITC標(biāo)記羊抗兔IgG和200×稀釋的0.05%的伊文氏蘭(終濃度0.025%)，室溫避光作用2小時(shí)，沖洗3次，吸干，滴加抗熒光猝滅封片劑，倒置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。FITC所用激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，在圖像分析系統(tǒng)中選擇目標(biāo)區(qū)域取圖，并做Z軸方向的光切片合成。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，rhIFN-α2B處理的293T細(xì)胞提取RNA，RT-PCR擴(kuò)增后，在400 bp處可見明顯的擴(kuò)增條帶(圖1A)，擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果與理論值相符，證明得到IFITM3基因。將IFITM3克隆入pMD18-T載體上，經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，凝膠電泳結(jié)果顯示，在400 bp和3 100 bp處可見明顯條帶(圖1B)，證明IFITM3片段已連接至T載體中。測(cè)序結(jié)果如圖2示，與Gen-Bank中 IFITM3完全一致，證明成功獲得 IFITM3基因。

2.2 重組質(zhì)粒pV-IFITM3的鑒定 質(zhì)粒pV-IFITM 3經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，可見400 bp左右的目的條帶(圖3)，表明構(gòu)建成功。

2.3 RT-PCR鑒定IFITM3基因在293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄 提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pV-IFITM3的293T細(xì)胞的mRNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增IFITM3，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RT-PCR擴(kuò)增后在400 bp處有明顯條帶，但是在空載體pVAX1及陰性細(xì)胞對(duì)照中也同樣出現(xiàn)目的條帶(圖4A)，表明293T細(xì)胞含有內(nèi)源性IFITM3的表達(dá)，但與轉(zhuǎn)染IFITM3的質(zhì)粒相比，條帶較弱，表明IFITM3基因在293T細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)錄，設(shè)β-actin為內(nèi)參對(duì)照(圖4B)。

圖1 IFITM3擴(kuò)增及pMD-IFITM3質(zhì)粒酶切鑒定Fig．1 Amplification of IFITM3 and restriction enzyme digestion of pMD18-T-IFITM3

圖2 IFITM3的核酸與氨基酸序列Fig．2 Nucleic acid and amino acid sequence of IFITM3

圖3 pV-IFITM3質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳Fig．3 Agarose gel of pV-IFITM3 restriction enzyme digestion

圖4 IFITM3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄檢測(cè)Fig．4 mRNA transcription identification of IFITM3 gene

2.4 IFITM3基因表達(dá)蛋白的免疫印跡檢測(cè) 利用Western blot對(duì)轉(zhuǎn)染pV-IFITM3質(zhì)粒的293T細(xì)胞蛋白進(jìn)行表達(dá)鑒定?；瘜W(xué)發(fā)光ECL法顯影檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，樣品1和2在17 kD有明顯條帶，表明IFITM3基因在293T細(xì)胞中表達(dá)，且具有良好的抗體結(jié)合能力。另外，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)有所不同，未能檢測(cè)到內(nèi)源性IFITM3蛋白水平的表達(dá)。表明內(nèi)源性IFITM3存在mRNA水平的表達(dá)，但其由于某種原因不能夠翻譯成蛋白或翻譯后很快被降解，從而在蛋白水平檢測(cè)不到，但具體原因有待于更進(jìn)一步研究。

2.5 IFITM3蛋白的定位 利用間接免疫熒光結(jié)合激光共聚集對(duì)轉(zhuǎn)染pV-IFITM3質(zhì)粒后293T細(xì)胞表達(dá)的IFITM3蛋白進(jìn)行定位研究。由圖6可以看出，IFITM3基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)后，表達(dá)的外源蛋白主要分布于細(xì)胞膜上。

圖5 IFITM3基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)后蛋白Western blot檢測(cè)Fig．5 Western blot analysis of the expression of the 48 h protein of 293T cell transfected by IFITM3 gene

圖6 IFITM3基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)后蛋白免疫熒光檢測(cè)Fig．6 IFA analysis of the expression of the 48 h protein of 293T cell transfected by IFITM3 gene

3 討論

干擾素(IFN)是一類重要的具有生理功能的細(xì)胞因子，其不僅可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，而且可干擾病毒的復(fù)制，被廣泛應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療。但干擾素本身沒有直接的抗病毒作用，其主要通過與細(xì)胞的干擾素受體(IFNR)結(jié)合，從而誘導(dǎo)大量的干擾素刺激因子(ISGs)的表達(dá)，通過這些產(chǎn)生的ISGs達(dá)到抗病毒的目的。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM)就是ISGs中的一類。在人體中已發(fā)現(xiàn)的4個(gè)IFITMs中(IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5)，除 IFITM5在骨鹽沉積中的作用研究的比較清楚外，其他三個(gè)IFITMs的研究還不夠深入[8]。近期研究表明，IFITM3在抑制大多數(shù)囊膜病毒早期感染過程中發(fā)揮著重要作用，過表達(dá)IFITM3能夠抑制病毒感染，敲低或敲除IFITM3后，病毒對(duì)細(xì)胞的敏感性顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步研究表明，IFITM3系干擾素發(fā)揮抗病毒活性所必需，但I(xiàn)FITM3如何抑制病毒感染卻不清楚[9，10]。因此，開展 IFITM3 相關(guān)研究，將為更好地理解病毒與宿主之間的關(guān)系提供重要線索，為此類分子的抗病毒臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究著眼于IFITM3基因的克隆及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)與定位，利用人干擾素α2B(rhIFN-α2B)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胚腎293T細(xì)胞，采用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增獲得干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白IFITM3全長(zhǎng)cDNA，將IFITM3基因亞克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pV-IFITM3，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，IFITM3得到正確轉(zhuǎn)錄，同時(shí)空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)IFITM3 mRNA的表達(dá)，但轉(zhuǎn)染組mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，表明在293T細(xì)胞中存在內(nèi)源性IFITM3在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。進(jìn)一步蛋白水平的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，只有轉(zhuǎn)染含有目的基因質(zhì)粒(pVAX1-IFITM3)出現(xiàn)目的條帶，而對(duì)照組無，一方面表明構(gòu)建的目的基因可以成功表達(dá)且具有抗原活性。另一方面也說明雖然靜息的293T細(xì)胞中存在IFITM3 mRNA的表達(dá)，但由于某種原因其不能翻譯為蛋白，或者翻譯的蛋白量少，或者蛋白翻譯后被快速降解，致使在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后不能檢測(cè)到，但具體原因有待于進(jìn)一步研究。該研究提示，在人類正常細(xì)胞中即使存在IFITM3內(nèi)源性mRNA的表達(dá)，但由于其不能夠進(jìn)一步大量翻譯為具有生物功能的蛋白，從而限制了其抗病毒活性的發(fā)揮，所以導(dǎo)入外源性的IFITM3，將有可能改變這一現(xiàn)狀，從而為新型抗病毒藥物的研制以及轉(zhuǎn)基因抗病毒育種研究提供了重要線索。

在進(jìn)行IFITM3的定位實(shí)驗(yàn)中，選用轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的細(xì)胞蛋白進(jìn)行FITC抗體標(biāo)記檢測(cè)，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，IFITM3為遍在表達(dá)(結(jié)果略)，這與之前其他人研究結(jié)果相同[4-6]，但到48小時(shí)后，IFITM3蛋白大都集中于細(xì)胞膜上，其機(jī)制還需要深入探討。

總之，本研究在國內(nèi)率先成功獲得了人源的IFITM3基因，并在真核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，RT-PCR、Western blot均表明該基因能夠表達(dá)，且具有良好抗原活性;激光共聚焦顯微鏡觀察，IFITM3基因在后期主要分布于細(xì)胞膜上，該研究為基于IFITM3的抗病毒藥物研發(fā)以及探討其抗病毒機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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