朱 娜 李 昌 郭 焱 李 沂 孫丹丹 任靜強 杜壽文 秦艷青 王茂鵬 田宇飛 金寧一

(軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

細胞通過模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識別病原微生物的病原相關分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，誘導信號級聯(lián)反應，激活轉錄因子，進而激活特定的細胞因子和趨化因子的表達，使機體處于抗感染狀態(tài)。其中最主要的就是誘導干擾素(Interferon，IFN)，特別是Ⅰ型IFN(IFNα/β)的表達。Ⅰ型IFN通過特異性結合到病毒感染和非感染細胞表面的干擾素受體(Interferon receptor，IFNR)，從而誘導數(shù)百個干擾素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表達，啟動或調節(jié)機體的免疫應答[1]。在ISGs中，干擾素誘導的跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane proteins，IFITMs)是其中較為重要的一種，其表達后除調節(jié)細胞的粘附、影響細胞分化外，還與體內細胞信號轉導、腫瘤的形成、生殖細胞的歸巢和成熟、骨鹽的沉積以及抗病毒反應等活動有關[2]。

IFITM3是近期發(fā)現(xiàn)的一種具有廣譜抗囊膜病毒活性的蛋白。在人體內，IFITM基因家族含有4個成員，即 IFITM1、IFITM2、IFITM3 和 IFITM5[3]。已經(jīng)證實IFITM1、IFITM2和IFITM3可以由Ⅰ型或Ⅱ型IFN誘導產(chǎn)生，它們對甲型流感病毒的多個亞型(H1、H3、H5及H7)都有很強的抑制作用，其中IFITM3的抑制效果最強，同時IFITM3還對登革熱病毒(Dengue Virus)、西尼羅河病毒(West Nile Virus)、SARS-Co冠狀病毒(SARS Coronavirus)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)等其他不同類型的病毒均有抑制效果[4-6]。缺失IFITM3后IFN的抗病毒反應會明顯變弱，所以IFITM3在干擾素反應中發(fā)揮著重要作用，為人體抗病毒免疫所必需[7]。

為此，我們通過人Ⅰ型 IFN(rhIFNα2B)誘導293T細胞，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，進行IFITM3的擴增，并將其構建到真核表達載體中，開展其表達與鑒定的研究，該結果為進一步研究IFITM3基因的功能和生物學活性以及作用機制奠定了堅實基礎，目前國內尚未見相關研究報道。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌種和載體 大腸桿菌E．coli DH5α、人胚胎腎細胞293T由本實驗室保存;pVAX1載體為Invitrogen公司產(chǎn)品;pMD18-T simple Vector為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑和儀器 rhIFNα2B干擾素購自Peprotech公司;RIPA裂解液購自Beyotime公司;質粒回收試劑盒購自Axygen公司;質粒制備試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司;胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自Hykolong公司;opti-MEM培養(yǎng)液購自Gibco;FuGEENE HD轉染試劑購自Roche公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和FITC標記山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物技術有限公司;兔源IFITM3 PolyClonal Antibody購自武漢三鷹生物技術有限公司;鼠源Anti-beta-actin Monoclonal Antibody購自聯(lián)科生物;抗熒光猝滅封片液購自碧云天。

英國TECHNE TC512 PCR儀;熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;Thermo Scientific公司的NANODROP 2000 Spectrophotometer;激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.3 IFITM3基因的擴增 人胚胎腎細胞細胞系293T細胞貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清及1%青、鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將指數(shù)生長期的293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×106個細胞，培養(yǎng)過夜。第2天將 rhIFN-α2B稀釋液5 μl(濃度1.33×10-5g/ml)加到細胞培養(yǎng)上清液中，孵育12小時。TRIzol法提取細胞RNA，反轉錄成cDNA，進行PCR擴增，上游引物:ggggatccgccaccatgaatcacactgtccaaac;下游引物:gggaattcctagtggtggtggtggtggtgtccataggcctggaaga。其中上游引物含有EcoRⅠ酶切位點和kozak序列，下游含BamHⅠ酶切位點及his-tag標簽，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR反應體系為:cDNA模板 1 μl，2.5 mol dNTP 2.5 μl，rTaq Buffer 2.5 μl，rTaq 1μl，上、下游引物各1 μl，RNase-free 水16 μl，使反應體系終體積為25 μl，離心混勻。PCR程序為:95℃預變性5分鐘，94℃變性 30秒，56℃退火 30秒，72℃延伸 45秒，擴增30個循環(huán)，72℃后延伸10分鐘，4℃保存。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple Vector載體連接，命名為pMD-IFITM3，轉入DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切初步鑒定正確后，送往北京華大中天生物公司測序。

1.4 重組質粒的構建 用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切經(jīng)測序正確的pMD-IFITM3，凝膠回收目的片段，并與相同酶切的pVAX1相連，命名為pV-IFITM3，然后轉入DH5α感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性篩選，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質粒，并用 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定。

1.5 質粒的制備與純化 常規(guī)方法大量制備重組質粒pV-IFITM3，詳細操作步驟參見北京百泰克質粒大量制備試劑盒說明書。然后測定質粒濃度及D260/D280值，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞轉染 293T細胞生長至80%～90%融合時，取適量重組質粒pV-IFITM3，利用FuGEENE HD轉染試劑轉染，質粒和FuGEENE HD比例為3μg質粒和8 μl轉染試劑，孵育8小時，設載體pVAX1質粒轉染及未轉染細胞作為陰性對照。

1.7 IFITM3的RT-PCR檢測 采用TRIzol法提取細胞總RNA，RT-PCR擴增IFITM3基因，鑒定基因的轉錄情況。IFITM3引物及擴增方法參照1.3進行。

1.8 Western blot檢測IFITM3在293T細胞中的表達 重組質粒pV-IFITM3轉染293T細胞，方法同1.6，轉染后培養(yǎng)48小時后，提取細胞蛋白，取2 μl細胞蛋白提取液用分光光度計測定樣品蛋白含量，測蛋白濃度 ＞5 mg/ml。取蛋白樣品(600 μg)按4∶1溶于5×loading buffer樣品上樣緩沖液中，混勻，沸水煮沸10分鐘，15%SDS-PAGE凝膠電泳，將分離的蛋白電轉移至NC(0.45 μm)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時，然后分別與5%脫脂奶粉2 000×稀釋的IFITM3抗體4℃孵育12小時，PBST洗滌3次，每次5分鐘，加入5%脫脂奶粉2 000×稀釋的二抗室溫孵育3小時，用PBST漂洗3次，每次10分鐘，化學發(fā)光ECL法顯影檢測IFITM3表達，并以β-actin作為內參照。

1.9 重組蛋白的激光共聚集檢測 將指數(shù)生長的293T細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，孔底附有玻片，每孔接種1×106個細胞，培養(yǎng)至細胞生長80% ～90%融合時，進行轉染實驗，方法同1.6，轉染后培養(yǎng)24小時，待細胞生長到接近長滿單層時，取出玻片，用 PBS液沖洗 3次，分析純甲醇(-20℃)固定30分鐘，再用 PBS液洗滌3次，用5%脫脂奶粉封閉2小時，PBS液沖洗3次，每次5分鐘，加入5%脫脂奶粉2 000×稀釋的IFITM3一抗，室溫作用2小時后，PBS液沖洗3次，加入5%脫脂奶粉200×稀釋的FITC標記羊抗兔IgG和200×稀釋的0.05%的伊文氏蘭(終濃度0.025%)，室溫避光作用2小時，沖洗3次，吸干，滴加抗熒光猝滅封片劑，倒置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。FITC所用激發(fā)波長為488 nm，在圖像分析系統(tǒng)中選擇目標區(qū)域取圖，并做Z軸方向的光切片合成。

2 結果

2.1 目的基因的獲得 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，rhIFN-α2B處理的293T細胞提取RNA，RT-PCR擴增后，在400 bp處可見明顯的擴增條帶(圖1A)，擴增片段的電泳結果與理論值相符，證明得到IFITM3基因。將IFITM3克隆入pMD18-T載體上，經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，凝膠電泳結果顯示，在400 bp和3 100 bp處可見明顯條帶(圖1B)，證明IFITM3片段已連接至T載體中。測序結果如圖2示，與Gen-Bank中 IFITM3完全一致，證明成功獲得 IFITM3基因。

2.2 重組質粒pV-IFITM3的鑒定 質粒pV-IFITM 3經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，可見400 bp左右的目的條帶(圖3)，表明構建成功。

2.3 RT-PCR鑒定IFITM3基因在293T細胞中的轉錄 提取轉染重組質粒pV-IFITM3的293T細胞的mRNA，經(jīng)RT-PCR擴增IFITM3，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，RT-PCR擴增后在400 bp處有明顯條帶，但是在空載體pVAX1及陰性細胞對照中也同樣出現(xiàn)目的條帶(圖4A)，表明293T細胞含有內源性IFITM3的表達，但與轉染IFITM3的質粒相比，條帶較弱，表明IFITM3基因在293T細胞中獲得轉錄，設β-actin為內參對照(圖4B)。

圖1 IFITM3擴增及pMD-IFITM3質粒酶切鑒定Fig．1 Amplification of IFITM3 and restriction enzyme digestion of pMD18-T-IFITM3

圖2 IFITM3的核酸與氨基酸序列Fig．2 Nucleic acid and amino acid sequence of IFITM3

圖3 pV-IFITM3質粒酶切瓊脂糖凝膠電泳Fig．3 Agarose gel of pV-IFITM3 restriction enzyme digestion

圖4 IFITM3基因的mRNA轉錄檢測Fig．4 mRNA transcription identification of IFITM3 gene

2.4 IFITM3基因表達蛋白的免疫印跡檢測 利用Western blot對轉染pV-IFITM3質粒的293T細胞蛋白進行表達鑒定。化學發(fā)光ECL法顯影檢測結果如圖5所示，樣品1和2在17 kD有明顯條帶，表明IFITM3基因在293T細胞中表達，且具有良好的抗體結合能力。另外，該結果與轉錄水平的檢測有所不同，未能檢測到內源性IFITM3蛋白水平的表達。表明內源性IFITM3存在mRNA水平的表達，但其由于某種原因不能夠翻譯成蛋白或翻譯后很快被降解，從而在蛋白水平檢測不到，但具體原因有待于更進一步研究。

2.5 IFITM3蛋白的定位 利用間接免疫熒光結合激光共聚集對轉染pV-IFITM3質粒后293T細胞表達的IFITM3蛋白進行定位研究。由圖6可以看出，IFITM3基因轉染293T細胞48小時后，表達的外源蛋白主要分布于細胞膜上。

圖5 IFITM3基因轉染293T細胞48小時后蛋白Western blot檢測Fig．5 Western blot analysis of the expression of the 48 h protein of 293T cell transfected by IFITM3 gene

圖6 IFITM3基因轉染293T細胞48小時后蛋白免疫熒光檢測Fig．6 IFA analysis of the expression of the 48 h protein of 293T cell transfected by IFITM3 gene

3 討論

干擾素(IFN)是一類重要的具有生理功能的細胞因子，其不僅可以調節(jié)機體的免疫反應，而且可干擾病毒的復制，被廣泛應用于疾病的預防與治療。但干擾素本身沒有直接的抗病毒作用，其主要通過與細胞的干擾素受體(IFNR)結合，從而誘導大量的干擾素刺激因子(ISGs)的表達，通過這些產(chǎn)生的ISGs達到抗病毒的目的。干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM)就是ISGs中的一類。在人體中已發(fā)現(xiàn)的4個IFITMs中(IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5)，除 IFITM5在骨鹽沉積中的作用研究的比較清楚外，其他三個IFITMs的研究還不夠深入[8]。近期研究表明，IFITM3在抑制大多數(shù)囊膜病毒早期感染過程中發(fā)揮著重要作用，過表達IFITM3能夠抑制病毒感染，敲低或敲除IFITM3后，病毒對細胞的敏感性顯著增強，進一步研究表明，IFITM3系干擾素發(fā)揮抗病毒活性所必需，但IFITM3如何抑制病毒感染卻不清楚[9，10]。因此，開展 IFITM3 相關研究，將為更好地理解病毒與宿主之間的關系提供重要線索，為此類分子的抗病毒臨床應用提供理論依據(jù)。

本研究著眼于IFITM3基因的克隆及其在真核細胞中的表達與定位，利用人干擾素α2B(rhIFN-α2B)誘導體外培養(yǎng)的人胚腎293T細胞，采用RTPCR技術擴增獲得干擾素誘導的跨膜蛋白IFITM3全長cDNA，將IFITM3基因亞克隆至真核表達載體pVAX1中獲得重組表達質粒pV-IFITM3，轉染293T細胞。RT-PCR檢測結果表明，IFITM3得到正確轉錄，同時空載體轉染組、未轉染組均出現(xiàn)IFITM3 mRNA的表達，但轉染組mRNA的表達量明顯高于對照組，表明在293T細胞中存在內源性IFITM3在轉錄水平的表達。進一步蛋白水平的免疫印跡檢測結果顯示，只有轉染含有目的基因質粒(pVAX1-IFITM3)出現(xiàn)目的條帶，而對照組無，一方面表明構建的目的基因可以成功表達且具有抗原活性。另一方面也說明雖然靜息的293T細胞中存在IFITM3 mRNA的表達，但由于某種原因其不能翻譯為蛋白，或者翻譯的蛋白量少，或者蛋白翻譯后被快速降解，致使在轉染48小時后不能檢測到，但具體原因有待于進一步研究。該研究提示，在人類正常細胞中即使存在IFITM3內源性mRNA的表達，但由于其不能夠進一步大量翻譯為具有生物功能的蛋白，從而限制了其抗病毒活性的發(fā)揮，所以導入外源性的IFITM3，將有可能改變這一現(xiàn)狀，從而為新型抗病毒藥物的研制以及轉基因抗病毒育種研究提供了重要線索。

在進行IFITM3的定位實驗中，選用轉染24小時后的細胞蛋白進行FITC抗體標記檢測，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，IFITM3為遍在表達(結果略)，這與之前其他人研究結果相同[4-6]，但到48小時后，IFITM3蛋白大都集中于細胞膜上，其機制還需要深入探討。

總之，本研究在國內率先成功獲得了人源的IFITM3基因，并在真核細胞中進行了表達，RT-PCR、Western blot均表明該基因能夠表達，且具有良好抗原活性;激光共聚焦顯微鏡觀察，IFITM3基因在后期主要分布于細胞膜上，該研究為基于IFITM3的抗病毒藥物研發(fā)以及探討其抗病毒機制研究奠定了堅實基礎。

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