熊媛媛，黃 濤，鄭 佳，漆世華，謝紅玲，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起幼齡家畜腹瀉的主要病因之一[1]，而其致病作用與黏附性纖毛和腸毒素密切相關。ETEC菌株是通過細菌的纖毛與宿主小腸上皮細胞表面的相應受體結合，從而在該局部組織黏附、定居、繁殖和產(chǎn)生毒素，導致腹瀉[2]。引起仔豬腹瀉的纖毛抗原主要是K88、K99、987P和F41[3]。纖毛抗原具有良好的免疫原性，免疫機體后能產(chǎn)生相應的纖毛抗體，對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌具有免疫作用。由于幼畜起病早、發(fā)病快，應利用纖毛抗原免疫懷孕母豬，產(chǎn)生特異性纖毛抗體，仔豬可通過被動免疫途徑獲得保護。

仔豬黃痢是由致病性大腸桿菌引起出生仔豬發(fā)生的一種急性、高度致死性腸道傳染病。目前國內(nèi)外有關預防仔豬大腸桿菌病(仔豬黃痢)的疫苗報道較多，以滅活疫苗和基因工程苗為主。國內(nèi)已獲批準的有K88、K99雙價基因工程苗，全菌苗為用K88、K99、987P菌株研制的仔豬大腸桿菌病三價滅活疫苗。為生產(chǎn)高效特異性疫苗，必須進行K88、K99、987P纖毛的純化，抗血清制備及纖毛抗原的定量檢測工作。本研究旨在純化纖毛抗原，制備高效價、高特異性的 K88、K99、987P抗血清，為K88、K99、987P菌株的鑒定及纖毛抗原的定性和定量測定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基、試劑 大腸桿菌 C83549(O149:K88ac)、C83644(O68:K99)、C83710 菌株(O9:987P)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定和供應。改良Minca湯培養(yǎng)基，由北京中海生物科技有限公司提供。K88、K99、987P單因子血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。BCA蛋白定量試劑盒，Thermo Scientific;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，Sigma。

1.2 細菌培養(yǎng) 細菌用相應的K88、K99、987P單因子血清做平板凝集反應，達到強陽性反應，然后接種改良Minca肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜培養(yǎng)16～20 h;菌液離心，收集菌泥，用1/10原菌液量的0.01 mol/L pH 7.2 PBS重懸。

1.3 纖毛提純

1.3.1 K88、K99纖毛提純 將濃縮后的菌液55～62℃加熱20～30 min，期間不斷搖晃;15000 g離心30 min，取上清;加入固體硫酸銨至飽和度為30%，4℃放置過夜;15000 g離心30 min，收集沉淀，用少量0.01 mol/L pH 7.2 PBS懸浮，透析;進行SDSPAGE電泳，檢驗K88、K99纖毛提純的效果;BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。檢測方法參考試劑盒中提供的使用說明。

1.3.2 987P纖毛提純 將濃縮后的菌液55～62℃加熱20～30 min，期間不斷搖晃;15000 g離心30 min，取上清;加入固體氯化鈉使其終濃度為1 mol/L，4℃放置1 h;15000 g離心30 min，收集沉淀，用少量0.01 mol/L pH 7.2 PBS懸浮、透析;進行SDS-PAGE電泳，檢驗987P纖毛提純的效果;BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。

1.4 纖毛掃描電鏡觀察 將純化的纖毛抗原在經(jīng)Formvar膜包被的銅網(wǎng)上負染，電鏡觀察(K88、K99，F(xiàn)EI Tecnai G220 TWIN;987P，HITACHI H-7000FA)。

1.5 抗血清制備 選擇體重1.5～2.0 kg的健康家兔，用0.01 mol/L pH 7.2 PBS將純化的纖毛抗原稀釋為蛋白質(zhì)濃度0.5 mg/mL，與等量弗氏完全佐劑混合制成乳劑，作為首次免疫抗原，腿部肌肉多點注射，2 mL/只。2周后，用同樣的抗原與等量弗氏不完全佐劑混合制成乳劑，作為二次免疫抗原，注射方法與劑量同首次免疫。再過2周，以1 mg/mL濃度的抗原加弗氏不完全佐劑制成乳劑，進行三次免疫，注射方法與劑量同首次免疫。用瓊脂擴散試驗檢測血清效價，待血清瓊擴效價達1∶32以上時，心臟采血，分離血清，經(jīng)56℃水浴滅活30 min，加0.01%硫柳汞，置-40℃保存。

1.6 血清效價測定 采用瓊脂擴散試驗對所制備的K88、K99、987P抗血清進行效價的測定。用0.01 mol/L pH 7.2 PBS配制1%瓊脂糖凝膠，加0.01%硫柳汞，用平板制成3 mm厚的凝膠板，用梅花打孔器打孔。在中央孔加滿純化的纖毛抗原，外周孔加滿相應不同稀釋度的抗血清，稀釋倍數(shù)依次為 8、16、32、64、128;并用相應的K88、K99、987P單因子血清作為陽性對照，置25℃濕盒內(nèi)擴散24～48 h，觀察結果。

2 結果

2.1 纖毛抗原純化 SDS-PAGE電泳顯示，純化的K88、K99、987P纖毛為高純度的纖毛抗原，目的蛋白分子量分別約為26、18、20 kD(圖1)。

圖1 纖毛抗原純化的SDS-PAGE結果

2.2 纖毛抗原的電鏡觀察 電鏡負染觀察，純化的K88纖毛為柔軟絲狀的結構特征;K99呈微絲樣結構;987P纖毛可見縱橫交錯排列、剛硬的結構特征(圖2)，三種纖毛均有強烈的聚集傾向，這與之前的報道[4-6]是一致的。

圖2 大腸桿菌K88、K99和987P纖毛形態(tài)

2.3 血清效價的測定 瓊脂擴散試驗測定了K88、K99、987P 抗血清的效價，依次為 1 ∶32、1∶32、1∶128。抗血清及相應纖毛抗原之間出現(xiàn)單一沉淀線，且沉淀線與陽性對照的沉淀線相連(圖3)，而不與其他纖毛抗原出現(xiàn)沉淀線。因此所制備的K88、K99、987P抗血清均具有高特異性。

圖3 抗血清瓊擴效價的測定結果

3 討論

3.1 纖毛表達量 試驗中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K88的纖毛表達量一直很穩(wěn)定，但從凍干菌種復蘇的大腸桿菌K99、987P的產(chǎn)纖毛量很少，因此獲得能夠穩(wěn)定且高表達纖毛的大腸桿菌非常重要，可通過玻板凝集試驗檢測纖毛的表達量。大腸桿菌987P在胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSA/TSB)中傳代幾次，987P纖毛的表達量大大提高。纖毛表達量除了與菌株本身的特性有關外，還與培養(yǎng)基、溫度等因素有關[7]。

3.2 纖毛抗原的純化 得到高純度的纖毛抗原是本試驗的關鍵。目前，常用的脫纖毛方法有兩種，即加熱法和高速勻漿法。同時采用這兩種方法，使脫纖毛更加完全[8]，即先采用55～62℃加熱20～30 min，再用高速勻漿法脫纖毛。加熱后80%以上的纖毛已從菌體上脫落，而高速勻漿僅能使較少的纖毛脫落，這與 de Graaf等[9]報道一致。另外，經(jīng)高速勻漿處理后，含有更多的雜蛋白，可能與高速勻漿導致菌體破碎有關。

熱脫后的K88、K99纖毛抗原經(jīng)硫酸銨沉淀，可獲得較純的目的蛋白。試驗中比較了不同飽和度硫酸銨沉淀纖毛的效果，結果表明，硫酸銨飽和度為30%時，纖毛蛋白沉淀完全且純度高，隨著飽和度的增加，雜蛋白增多，該結果與文獻[10]所述一致。同時試驗比較了三種方法來純化987P纖毛，分別為硫酸銨鹽析、等電點法[4]、氯化鈉鹽析。結果表明，經(jīng)1 mol/L NaCl處理，目的蛋白全部沉淀下來，且無雜蛋白，方法簡單且省時;等電點法純化效果好，但非常費時費力;硫酸銨鹽析存在少量雜蛋白。因此，選用氯化鈉鹽析純化987P纖毛。

3.3 纖毛分子量 本試驗提純的K88纖毛的分子量大小約為26 kD，這與李虹等[8]報道的25 kD基本一致。關于K99纖毛分子量的大小，文獻報道存在一定的差異。de Graaf等[9]測出的分子量為18.5 kD，Karkhanis等[11]測出的分子量大小為17 kD，朱良全等[12]報道的為18 kD，這些與本試驗提純的K99纖毛分子量(約18 kD)接近。Altmann等估算其分子量大小為12.3～12.9 kD[5]及13 kD[13]。Isaacson[6]報道 K99 纖毛由兩個亞單位組成，分子量為22.5 kD占多數(shù)，還有少數(shù)分子量為29.5 kD。

根據(jù)聚丙烯酰胺的濃度和巰基乙醇存在與否，987P的分子量的大小是可變的[14]。在5%聚丙烯酰胺條件下，有巰基乙醇時存在兩條帶，主要條帶分子量為20 kD，還有少部分分子量為26.5 kD;無巰基乙醇時分子量為20 kD;在11%聚丙烯酰胺條件下，有無巰基乙醇，其分子量分別為22 kD和19.4 kD。相同纖毛蛋白其分子量差異的原因，可能與菌株、環(huán)境有關，具體原因還未見相關文獻的報道。

3.4 纖毛抗血清 本試驗得到的K88、K99、987P抗血清的瓊擴效價依次為 1∶32、1∶32、1∶128。K88、K99抗血清的效價較低，是否可通過調(diào)整免疫程序，如從免疫途徑、接種劑量、免疫時間等方面來提高抗體的效價，還有待嘗試。特異性抗血清的制備為K88、K99、987P纖毛抗原定量檢測及產(chǎn)纖毛大腸桿菌菌株的鑒定奠定了基礎。

[1]Vu Khac H，Holoda E，Pilipcinec E，et al.Serotypes，virulence genes，and PFGE profiles of Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhoea in Slovakia[J].BMC Vet Res，2006，2:10.

[2]Jeyasingham M D，Butty P，King T P，et al.Escherichia coli K88 receptor expression in intestine of disease-susceptible weaned pigs[J].Veterinary Micmbiology，1999，68(3/4):219-234.

[3]Fairbrother J M，汪銘書.從腹瀉病新生仔豬分離的非傳統(tǒng)血清型E．coli的纖毛抗原和腸毒素檢測[J].國外獸醫(yī)學—畜禽傳染病，1989，9(3):26-28，

[4]Isaacson R E，Richter P.Escherichia coli 987P Pilus:Purification and Partial Characterization[J].Journal of Bacteriology，1981，146(2):784-789.

[5]Altmann K，Pyliotis N A，Mukkur T K.A new method for the extraction and purification of K99 pili from Enterotoxigenic Escherichia coli and their characterization[J].Biochemical Journal，1982，201(3):505-513.

[6]Isaacson R E.K99 Surface Antigen of Escherichia coli:Purification and Partial Characterization[J].Infection and Immunity，1977，15(1):272-279.

[7]崔德鳳，張永紅.腸毒素型大腸桿菌菌毛的研究進展[J].北京農(nóng)學院學報，2001，16(3):86-89.

[8]李 虹，朱良全，劉亞華，等.大腸桿菌K88纖毛抗原的提純和抗血清的制備[J].中國獸藥雜志，2006，40(12):23-26.

[9]de Graaf F K，Klemm P，Gaastra W.Purification，Characterization，and Partial Covalent Structure of Escherichia coli Adhesive Antigen K99[J].Infection and Immunity，1981，33(3):877-883.

[10]汪建華，唱韶紅，熊凌霜.K88抗原純化中硫酸銨沉淀法的改進[J].中國預防獸醫(yī)學報，2000，22(4):310-311.

[11]Karkhanis Y D，Bhogal B S.A Single-Step Isolation of K99 Pili from B-44 Strain of Escherichia coli[J].Analytical Biochemistry，1986，155(1):51-55.

[12]朱良全，李 虹，范書才.大腸桿菌K99纖毛抗原的提純和抗血清制備[J].中國獸醫(yī)雜志，2009，45(5):14-16.

[13]Altmann K，Pyliotis N A，Wetherall J D，et al.A Chromatographic Method for the Purification of K99 Pili from Enterotoxigenic Escherichia coli[J].Journal of General Microbiology，1983，129(6):1975-1982.

[14]Isaacson R E，Richter P.Escherichia coli 987P Pilus:Purification and Partial Characterization[J].Journal of Bacteriology，1981，146(2):784-789.