周井祥，李新偉，朱 霞，王 好，呂文亮

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118)

錦鯉皰疹病毒病(Kio herpesvirus disease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)引起錦鯉、鯉魚及其普通變種如框鏡鯉等發(fā)病的一種具有高度傳染性和致死性的疾病。

該病于1998年首次在以色列的Magan Michael地區(qū)和美國(guó)爆發(fā)[1]，其后迅速傳播至英國(guó)、德國(guó)、比利時(shí)和印度尼西亞等國(guó)，2002年中國(guó)廣東省錦鯉疑似發(fā)生本病[2]，其后該病在我國(guó)頻繁爆發(fā)，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了幾乎毀滅性的打擊。

KHV是線形雙股DNA病毒，是魚類皰疹病毒屬中基因組最大的病毒[3]。它有156個(gè)開放性閱讀框(ORF)，其中只有少數(shù)已經(jīng)確定其功能。ORF25和ORF99編碼膜糖蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[4]。

目前國(guó)內(nèi)還沒有有效的控制KHV的方法，本研究以吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)首次分離到的錦鯉皰疹病毒吉林株(KHV-CJ)基因組為模板，成功克隆到KHV糖蛋白-ORF25基因，并分析其生物學(xué)信息，旨在為進(jìn)一步研究錦鯉皰疹病毒的基因背景信息及基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存[5];框鏡鯉尾鰭原代細(xì)胞由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖保存。

密斯·凡德羅（Ludwig Mies·Van der Rohe,1886～1969）提出了“少則多”（Lessis more）的設(shè)計(jì)原則，所謂“少”是針對(duì)當(dāng)時(shí)建筑界流行的古典裝飾手法提出的，而“多”則指的是大工業(yè)條件下形式簡(jiǎn)潔而功能豐富的建筑。該設(shè)計(jì)觀念最初是為了追求所謂的單純建筑，引起了極大的爭(zhēng)議，但深遠(yuǎn)地影響了 20 世紀(jì)以來從事各個(gè)領(lǐng)域的設(shè)計(jì)師、設(shè)計(jì)教育，他可以說是 20 世紀(jì)對(duì)于世界設(shè)計(jì)影響最大的一個(gè)人物。

1.2 菌株與載體 pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，E．coli DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑 新生牛血清、M199培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品;Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、DNA Marker等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化有限公司。

（一）認(rèn)知周邊一些常見物的性質(zhì)、組成、以及該物質(zhì)在生活當(dāng)中的實(shí)際應(yīng)用；形成基礎(chǔ)的化學(xué)概念，能對(duì)事物的微觀構(gòu)成加以認(rèn)知，并了解物質(zhì)用途和物質(zhì)性質(zhì)間的關(guān)系，能自行的設(shè)計(jì)、完成基礎(chǔ)性的化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank上登錄的錦鯉皰疹病毒 ORF25基因序列，利用 Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物:P1 5'-GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3'，下游引物:P2 5'-GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3'，分別引入EcoRⅤ和EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)(劃線部位)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的PCR擴(kuò)增 按照Hasegawa等[6]和Neukirch等[7]的方法培養(yǎng)細(xì)胞。將KHV-CJ病毒液接種框鏡鯉尾鰭原代細(xì)胞(MFC)單層，收集病毒后提取病毒DNA，采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5 min，94℃ 40 s，59.3℃30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)。

1.6 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的克隆及鑒定 將目的片段純化回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選單菌落，提取重組質(zhì)粒后以EcoRⅤ和EcoRⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pMD18-T-25，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2.3.2 疏水性分析 通過ProtScale在線分析，ORF25的最大疏水指數(shù)為3.056，最小疏水指數(shù)為-3.067，其疏水性分析結(jié)果如圖3所示。

2.1 框鏡鯉尾鰭原代細(xì)胞(MFC)接種KHV后細(xì)胞病變 MFC接種KHV后，5～6 d出現(xiàn)細(xì)胞體積增大及少量的細(xì)胞空泡化，10 d后病變更加明顯，且細(xì)胞開始從瓶壁脫落(圖1)。

2 結(jié)果

1.8 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 從GenBank上分別下載錦鯉皰疹病毒日本株、美國(guó)株和以色列株的基因序列，利用DNAStar6.0(MegAligen)構(gòu)建不同錦鯉皰疹病毒株的ORF25基因進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。

“電力系統(tǒng)繼電保護(hù)”是由多門學(xué)科交叉的一門專業(yè)課，具體涉及電路原理、高等數(shù)學(xué)、電力電子、電機(jī)學(xué)等知識(shí)。課程的教學(xué)目的在于使學(xué)生掌握繼電保護(hù)原理以及分析方法，能夠熟練應(yīng)用多種繼電保護(hù)裝置，從而解決在實(shí)際工程中的繼電保護(hù)問題。

2.2 ORF25基因的PCR擴(kuò)增和鑒定 PCR擴(kuò)增出一條與目的片段大小相符的DNA片段(圖2)，pMD18-T-25用EcoRⅤ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，獲得一段約1824 bp的片段(圖2)，說明ORF25基因片段已成功克隆至載體中。

2.3 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 基因的序列測(cè)定和編碼蛋白分子特征 測(cè)序結(jié)果表明，ORF25基因長(zhǎng)1824 bp，為一完整的開放閱讀框，編碼608個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)ORF25基因的理論分子質(zhì)量為66825.44 Da，等電點(diǎn)為7.947。

1.7 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用DNAStar軟件翻譯出 ORF25基因的核苷酸序列;利用ProtScale(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)軟件分析蛋白的疏水性;利用BepiPred1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)軟件和DNAStar6.0(Protean)對(duì)ORF25序列編碼的蛋白進(jìn)行抗原表位分析;分別利用 NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和YinOYang1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)在線分析軟件進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用 NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

圖3 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25編碼蛋白的疏水性分析

2.3.4 糖基化及磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 分別通過NetNGlyc1.0在線分析軟件和YinOYang1.2在線分析軟件對(duì)錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，其氨基酸序列存在6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)、25個(gè)潛在的 O-糖基化位點(diǎn)。用NetPhos2.0在線分析軟件對(duì)錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)閾值取0.5時(shí)，其氨基酸存在28個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。

（3）砍樹?，F(xiàn)狀部分渠段渠道開口處種植有楊樹，在工程施工時(shí)需對(duì)施工有影響的樹進(jìn)行砍伐。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，本工程共伐樹1700株，其中胸徑小于15cm的有1379株，胸徑大于15cm且小于30cm的有321株。

圖4 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的抗原表位分析

2.3.3 抗原表位分析 用http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在線軟件及 DNAStar 6.0(Protean)對(duì)錦鯉皰疹病毒ORF25基因編碼的蛋白進(jìn)行抗原表位分析，得出其抗原表位主要集中在第61～69、78 ～87、109 ～136、164 ～174、179 ～196、219～257、273 ～291、357 ～372、385 ～390、476 ～524、527～573、578～606位氨基酸(圖4)。

重要性;認(rèn)真落實(shí)交接班制度,做到床旁交接,護(hù)士長(zhǎng)不定時(shí)晨會(huì)提問在班護(hù)士高風(fēng)險(xiǎn)患者;每周進(jìn)行2次安全檢查,包括門窗設(shè)施、保護(hù)性用具、患者用物等[5]。

2.4 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 從GenBank上分別下載錦鯉皰疹病毒日本株(KHV-J)、美國(guó)株(KHV-U)和以色列株(KHV-I)的ORF25基因，和本中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因構(gòu)建了分子進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，KHV-CJ與KHV-U處于一個(gè)分支，與KHV-U進(jìn)化關(guān)系稍近，與KHV-I進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

2011-2015年，臺(tái)灣對(duì)大陸農(nóng)耕產(chǎn)品貿(mào)易總值中所占份額較大的產(chǎn)品主要有谷類及其制品、水果、堅(jiān)果及其制品、砂糖及其制品、茶葉及其制品、酒類、植物油和其他農(nóng)耕產(chǎn)品；大部分農(nóng)耕產(chǎn)品的出口值逐年增加，尤其是谷類及其制品、水果、堅(jiān)果及其制品和其他農(nóng)耕產(chǎn)品(見圖1)。

圖5 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起錦鯉(Cyprinus carpio koi)和鯉魚(Cyprinus carpio)發(fā)病的一種高致病性疾病。該病多發(fā)生在水溫為18～28℃的春秋季節(jié)，具有高度傳染性，發(fā)病率和死亡率均可高達(dá)80% ～100%[4]。目前，錦鯉皰疹病毒病已在多國(guó)爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本實(shí)驗(yàn)成功獲得了長(zhǎng)1824 bp的ORF25基因。生物信息學(xué)分析表明其表達(dá)產(chǎn)物抗原性良好，其氨基酸序列存在6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)、25個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)以及28個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯前或翻譯后的一個(gè)重要修飾過程，并可提高蛋白基因組的多樣性[8]，其中N-糖基化作用位點(diǎn)與抗原性和免疫原性有關(guān)[9]。蛋白磷酸化是一種蛋白翻譯后的修飾作用，由蛋白激酶執(zhí)行。磷酸化在多種真核細(xì)胞的生命活動(dòng)中具有重要作用，例如保證有絲分裂 /細(xì)胞周期[10]、新陳代謝[10]以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]的正常運(yùn)行。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)ORF25基因與美國(guó)株的進(jìn)化關(guān)系最近，同源性為99%。

城鄉(xiāng)規(guī)劃中的農(nóng)村景觀設(shè)計(jì)應(yīng)遵循相應(yīng)的原則，提高城鄉(xiāng)規(guī)劃的整體質(zhì)量。為了遵循協(xié)調(diào)的原則，城鄉(xiāng)規(guī)劃中的農(nóng)村景觀設(shè)計(jì)具有不同的內(nèi)容類型，需要根據(jù)當(dāng)?shù)氐匦魏途坝^進(jìn)行規(guī)劃和設(shè)計(jì)，生態(tài)保護(hù)的要求和歷史文化的特點(diǎn).結(jié)合農(nóng)村景觀與園林景觀的設(shè)計(jì)規(guī)劃，提高了農(nóng)村景觀要素與內(nèi)容的和諧統(tǒng)一，促進(jìn)了農(nóng)村景觀的良好發(fā)展。農(nóng)村景觀與園林景觀的結(jié)合，規(guī)劃中地理特征的鮮明表現(xiàn)，區(qū)域文化的靈活融合和規(guī)劃設(shè)計(jì)的歷史發(fā)展，對(duì)提高城鄉(xiāng)規(guī)劃的整體質(zhì)量具有催化作用。

本研究在國(guó)內(nèi)首次選用KHV的糖蛋白基因-ORF25基因作為目的基因，以在我國(guó)分離到的錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株的DNA作為模板，成功將其克隆，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究錦鯉皰疹病毒的基因背景信息及基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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