馮 沖 李領(lǐng)川 趙國(guó)欣 董彩霞 李建新 華慧穎

玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂動(dòng)力學(xué)研究

馮 沖1李領(lǐng)川1趙國(guó)欣1董彩霞2李建新2華慧穎2

(中州大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心1，鄭州 450044)
(中州大學(xué)化工食品學(xué)院2，鄭州 450044)

對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母在玉米秸稈水解液中發(fā)酵合成微生物油脂動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究。采用Logistic菌體生長(zhǎng)模型、Luedeking－Piret模型和產(chǎn)物生成的基質(zhì)消耗模型，描述了完整發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)特性，提出了發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、微生物油脂合成、基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型。采用牛頓迭代法對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果表明，模型計(jì)算與試驗(yàn)數(shù)據(jù)能較好地?cái)M合，菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物油脂生成及糖分消耗等3條曲線的相關(guān)指數(shù)R2分別為0．990、0．987和0．890。表明該動(dòng)力學(xué)模型可以較好描述發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)特征。

玉米秸稈 發(fā)酵 生物油脂 動(dòng)力學(xué)模型 參數(shù)估計(jì)

秸稈是地球上豐富的可再生資源。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，世界秸稈年產(chǎn)量為20～30億t，中國(guó)每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量約7億t，占全世界秸稈總量的20%～30%［1］，其中玉米秸稈、小麥秸稈和稻稈占75%以上。一些產(chǎn)油微生物能夠有效利用各種農(nóng)林廢棄物及工業(yè)和農(nóng)副產(chǎn)品下腳料，直接轉(zhuǎn)化為微生物油脂，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生物柴油，這樣不但可以使廢棄物得到合理的利用，同時(shí)又開辟了一條清潔能源再生途徑。目前利用玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂已有報(bào)道，莫夏迪等［2］發(fā)現(xiàn)粘紅酵母有較強(qiáng)的生長(zhǎng)適應(yīng)能力，能在不添加其他任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的高粱秸稈汁里很好的生長(zhǎng)，并且能達(dá)到生物量16．73 g/L，油脂含量22．73%。潘麗霞等［3］利用蔗渣半纖維素水解物發(fā)酵產(chǎn)油，油脂得率系數(shù)分別為13．49和10．23，顯示了利用蔗渣這種廉價(jià)原料生產(chǎn)微生物油脂的潛力。馮沖等［4］對(duì)玉米秸稈稀酸水解液的脫毒后發(fā)酵產(chǎn)脂條件進(jìn)行了優(yōu)化，菌體生物量達(dá)21．2 g/L，油脂含量為50．9%。沈珺珺等［5］研究了產(chǎn)油酵母菌皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)利用經(jīng)過簡(jiǎn)單脫毒處理的大米草水解液，直接發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂，產(chǎn)油量最高達(dá)6．0 g/L。里偉等［6］以一株高產(chǎn)油脂圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidum toruloides Y4#)干菌粉為原料，分別研究了無溶劑體系中三步甲醇法及在叔丁醇介質(zhì)體系中脂肪酶催化合成微生物柴油，其得率可達(dá)90%左右。但玉米秸稈發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂的動(dòng)力學(xué)特性研究還未見報(bào)道。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是用數(shù)學(xué)模型定量描述發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成的動(dòng)態(tài)平衡及其內(nèi)在規(guī)律［7］，是工業(yè)放大過程中設(shè)計(jì)、操作和模擬優(yōu)化的基礎(chǔ)。建立動(dòng)力學(xué)模型并對(duì)發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析有助解決工業(yè)化生產(chǎn)中將會(huì)遇到的許多問題。本試驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室自行篩選的高產(chǎn)油脂菌株IFFI01368，對(duì)玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)生物油脂動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)IFFI01368購(gòu)自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

玉米秸稈(鄭州郊區(qū))切割粉碎30～40目。

商品木聚糖酶及纖維素酶產(chǎn)品購(gòu)于上海杰能科酶制劑公司，其中木聚糖酶酶活1．76×106u/mL，纖維素酶酶活2．07×106u/mL。

發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基配制方法見文獻(xiàn)［8］。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 玉米秸稈水解液的制備

每300 mL的三角瓶中稱取10 g玉米秸稈粉，在濃度為1%的稀硫酸，121℃條件下預(yù)處理60 min后，加入蒸餾水并調(diào)整到pH 5．0，液固比為10∶1，MgCl2為2．5 nmol/L，吐溫80為1．5 mL/L，加入纖維素酶2．5 g/100 g和木聚糖酶液2 mL/100 g，在50℃的條件下糖化48 h，經(jīng)普通濾紙過濾得水解糖化液。測(cè)得玉米秸稈的總還原糖濃度為(5．0±0．3)%，經(jīng)測(cè)定葡萄糖和木糖占總還原糖的(87±2)%［9－10］。在水解糖化液中，補(bǔ)加4%的蔗糖，pH 5．5，300 mL三角瓶盛裝玉米秸稈水解液50 mL，分裝，包扎，滅菌［8］。

1．2．2 種子液的制備

從活化的IFFI01368斜面挑取適量菌種，接入盛裝50 mL種子液培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)22 h，溫度27℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1．2．3 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)

分裝后的玉米秸稈水解液121℃滅菌20 min，然后將種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于秸稈水解液中進(jìn)行產(chǎn)脂發(fā)酵培養(yǎng)，條件為150 r/min，27℃，4 d。發(fā)酵過程中，每6 h取出3個(gè)三角瓶，測(cè)定菌體生物量，油脂含量及總糖含量。

1．2．4 分析測(cè)定方法

總糖含量測(cè)定:3，5一二硝基水楊酸(DNS)法［11］。

木糖含量測(cè)定:地衣酚法［12］。

菌體生物量的測(cè)定:通過4 500 r/min離心10 min，收集菌體并干燥(干燥溫度80℃)至衡重，準(zhǔn)確稱取干菌體量。

生物量(DW)=干菌體/發(fā)酵液

油脂抽提:精確稱取一定量粉碎后的干菌體，每克干菌體添加40 mL鹽酸水解法，室溫下靜置20 min，沸水浴加熱10 min，加入適量氯仿 － 甲醇(2∶1，體積比)，振蕩30 min，然后在4 500 r/min下離心15～20 min，分液，取氯仿層，真空干燥除去氯仿即得油脂，計(jì)算油脂得率［13］。

油脂含量=粗油脂質(zhì)量/菌體干重×100%油脂濃度=粗油脂質(zhì)量/發(fā)酵液體積

1．3 模型建立

1．3．1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)最常用方程有Monod方程和Logistic方程。由于Monod方程是理想化模型有一定的局限性，而Logistic方程是一個(gè)典型的S型曲線，能很好地反映發(fā)酵過程中普遍存在的菌體濃度增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用［14］。所以采用Logistic方程構(gòu)建菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型較為合適，Logistic方程為:

式中:k最大比生長(zhǎng)速率;Co初始菌體質(zhì)量濃度/g/L，本試驗(yàn)中Co=5．3 g/L;初始條件t=0時(shí)，菌絲體濃度Cx等于接種后的菌絲體Co;Cx菌體質(zhì)量濃度/g/L;CM最大菌體質(zhì)量濃度/g/L。

1．3．2 油脂生成動(dòng)力學(xué)模型

由酵母油脂發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)［15］可知，油脂的合成與菌體生長(zhǎng)為偶聯(lián)型，可以用Luedekingpirets方程來描述這一規(guī)律。即有:

式中:m1，m2為模型參數(shù)，Cx為菌體質(zhì)量濃度/g/L;P0為初始油脂含量，初始條件t=0時(shí)P0=0;P為油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1．3．3 底物消耗模型

菌體發(fā)酵過程中，底物的消耗一方面用于菌體的生長(zhǎng)，另一方面則用于產(chǎn)物的合成及其代謝，因此，底物消耗速度可由下式表示:

式中:Cx為底物糖濃度/g/L;Yx/s為對(duì)底物菌體的得率系數(shù)，g(菌體干重)/g(糖分);ke為細(xì)胞維持常數(shù)，g糖分/g(菌體干重)/h;Yp/s對(duì)底物產(chǎn)物的得率系數(shù)，g(產(chǎn)物)/g(糖分)。系數(shù)將為正值。S0為初始糖濃度，初始條件t=0時(shí)，S=S0=86．0 g/L;S(t)為時(shí)間t時(shí)的底物糖質(zhì)量濃度/g/L。

1．4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2000中的規(guī)劃求解對(duì)積分方程進(jìn)行分析處理計(jì)算，通過牛頓運(yùn)算法則，經(jīng)過100次迭代，使試驗(yàn)值和方程式預(yù)測(cè)值之間的誤差平方和SSE趨于最小。

2 結(jié)果與分析

2．1 產(chǎn)脂發(fā)酵過程

圖1 發(fā)酵過程菌體生物量、底物總糖濃度和產(chǎn)物油脂含量的變化

圖1 為玉米秸稈水解液發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、底物還原糖濃度和產(chǎn)物油脂含量隨時(shí)間變化的代謝曲線。由圖1可以看出，發(fā)酵前30 h，菌株處于生長(zhǎng)延遲期，耗糖速率較低，菌體生物量，油脂含量緩慢增加。30 h之后，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度逐漸加快，同時(shí)產(chǎn)物油脂生成速率加快，對(duì)應(yīng)著底物糖分的消耗。到78 h左右，進(jìn)入菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期，底物糖分基本耗盡，產(chǎn)物油脂變化很小，說明發(fā)酵周期可以控制在78 h之內(nèi)。在發(fā)酵后期，由于基質(zhì)糖分基本耗盡及發(fā)酵液中有毒物質(zhì)的作用，菌體死亡率上升，同時(shí)油脂含量降低，說明菌體可能在糖分耗盡后又開始以自身油脂作為碳源和能源。

2．2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

2．2．1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

對(duì)方程(1)積分可得生物量(Cx)與時(shí)間(t)函數(shù):

將模型參數(shù)代入方程(2)中，求得發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型如下:

圖2 發(fā)酵過程菌體生物量模型計(jì)算值與試驗(yàn)值比較

圖2 中菌體生物量試驗(yàn)值和模型擬合值的相關(guān)系數(shù)R2=0．990，說明此模型能夠很好地描述菌體在發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)情況。

2．2．2 油脂生成動(dòng)力學(xué)模型

將方程(1)代入方程(4)得:

將方程(2)代入方程(4)得積分方程(6):

將模型參數(shù)代入方程(6)中，求得發(fā)酵過程中產(chǎn)物的生成動(dòng)力學(xué)模型(7):

圖3 發(fā)酵過程產(chǎn)物油脂含量模型計(jì)算值與試驗(yàn)值比較

圖3 中菌體產(chǎn)脂試驗(yàn)值和模型擬合值的相關(guān)系數(shù)R2=0．987，說明此模型能夠很好地描述菌體在發(fā)酵過程中的油脂積累情況。

2．2．3 底物消耗模型

將方程(1)、方程(4)代入方程(8)可得:

將b1，b2代入積分得:

圖4 發(fā)酵過程底物還原糖濃度模型計(jì)算值與試驗(yàn)值比較

圖4 中菌體還原糖質(zhì)量濃度試驗(yàn)值和模型擬合值的相關(guān)系數(shù)R2=0．890，說明此模型能夠較好地描述菌體在發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)及產(chǎn)脂情況。

2．3 參數(shù)估計(jì)

綜合以上3部分動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果，經(jīng)過擬合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。

表1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

參數(shù)估值擬合結(jié)果如表1和圖2～圖4所示，采用相關(guān)指數(shù)R2來考察擬合效果，得到菌體生長(zhǎng)、油脂生成、糖分消耗等3條曲線的相關(guān)指數(shù)R2分別為0．990、0．987和0．890。由此可以看出，前兩者擬合效果很好，而糖分消耗擬合效果稍差，可能是由于在稀酸水解過程中會(huì)生成對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝有抑制作用的毒性物質(zhì)，例如甲酸、乙酸、糠醛、羥甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸等，影響了細(xì)胞對(duì)糖分的吸收。

3 結(jié)論

根據(jù)菌株IFFI01368發(fā)酵試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立了玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)脂過程的動(dòng)力學(xué)模型，描述了菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物油脂形成和底物糖分消耗變化的整個(gè)過程，采用牛頓迭代法對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行了非線性擬合。結(jié)果表明，菌體生長(zhǎng)、油脂生成、糖分消耗等3條曲線的相關(guān)指數(shù)R2分別為0．990、0．987和0．890。由表1和圖1～圖4可以看出，其擬合良好，所建立的模型較好地反映了玉米秸稈水解液發(fā)酵代謝過程基本特征及其動(dòng)力學(xué)機(jī)制，可用于進(jìn)一步設(shè)計(jì)大型發(fā)酵工藝。

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Dynamics Study on Microbial Oils Production by Corn Straw Hydrolysate Fermentation

Feng Chong1Li Lingchuan1Zhao Guoxin1Dong Caixia2Li Jianxin2Hua Huiying2
(Experimental Management Centre，Zhongzhou University1，Zhengzhou 450044)
(College of Chemical Engineering and Food Science，Zhongzhou University2，Zhengzhou 450044)

We performed research on dynamics speciality that using fermentation of the trichosporon fermentans into corn straw hydrolysate to synthetize microbial oils．The dynamics speciality of complete fermentation process was described based on Logitstic thallus growth model，Leudeking－Piret model and matrix consumption model that the product generated and dynamics models of thallus growth during fermentation，microbial oils synthesis and matrix consumption was also described．The parameters in the models were nonlinear fitting through Newton iterative method．The results showed that the predicted value by the dynamics models could fit well with the experimental data，and the relative index R2of the thallus growth，product lipid generating and sugar consumption were 0．990，0．987 and 0．890 respectively．The results also indicated that the dynamics models could better describe dynamics features of the process of trichosporon fermentans．

corn straw，fermentation，lipid，dynamics model，parameter estimation

Q936;S37

A

1003－0174(2012)10－0013－05

河南省教育廳2011自然科學(xué)基金(2011C1 80001)，鄭州市科技局2010年自然科學(xué)基金(10PTGG345－3)

2012－02－09

馮沖，女，1970年出生，講師，生物能源工程

華慧穎，女，1972年出生，副教授，生物能源和動(dòng)物遺傳