田燕，盧瑞春，郁金泰，譚蘭

（青島市市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266071）

阿爾茨海默?。ˋD）是一種病因不明的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，根據(jù)發(fā)病年齡（以65歲為界）分為早發(fā)性AD和遲發(fā)性AD（LOAD）。AD的發(fā)病與遺傳變異有關(guān)的觀點(diǎn)已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可［1］。載脂蛋白E（Apo E）ε4等位基因是目前已經(jīng)被證實(shí)的AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，但攜帶此等位基因的病人僅占38%［2］。因此，發(fā)現(xiàn)更多的遺傳基因標(biāo)記均對(duì)診斷和治療AD是非常有必要的。淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)激活在AD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。補(bǔ)體受體1（CR1）被認(rèn)為有助于清除淀粉樣β蛋白。最近有研究結(jié)果表明，CR1的基因多態(tài)性是否與高加索人的LOAD有關(guān)［3］。但是，CR1基因多態(tài)性與漢族人LOAD有關(guān)尚需研究證實(shí)。本研究旨在探討CR1基因多態(tài)性與LOAD發(fā)病的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

LOAD組254例為2006年9月—2010年10月我科的住院癡呆病人，其中男118例，女136例；平均年齡（78.4±6.7）歲；發(fā)病年齡為（72.6±6.8）歲。LOAD診斷均符合美國國立神經(jīng)病、語言機(jī)能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（NINCDS－ADRDA）的標(biāo)準(zhǔn)。均排除了其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，無AD及精神病家族遺傳史。對(duì)照組357例為來自我院體檢門診的健康人，其中男161例，女196例；平均年齡（78.7±6.4）歲。均無記憶和智能障礙，MMSE評(píng)分＞28；臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查均正常；均無自身免疫疾病、糖尿病、心肌梗死、哮喘及腦卒中病史。兩組均為中國北方漢族人。此項(xiàng)研究獲得研究對(duì)象的同意及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因提取 采集外周血5 mL，ACD抗凝，采用苯酚－氯仿法提取基因。

1.2.2 CR1基因多態(tài)性檢測 引物的設(shè)計(jì)和合成由上海生工公司完成。rs6656401引物序列：上游引物，5′－ACGTTGGATGGCTTGTAGATGCATCATTTCC－3′；下游引物，5′－ACGTTGGATGGACAGAAGAGCAAAGGACAC－3′；擴(kuò)增引物，5′－ACACACAGAGGAGAAGGCGA－3′。rs3818361引物序列：上游引物，5′－ACGTTGGATGAAAGGACAGTTCCAGAGCAC－3′；下游引物，5′－ACGTTGGATGTTTTAAGCCCTCTGGTAAGC－3′；擴(kuò)增引物，5′－CCTCTGGTAAGCATAAGATATA－3′。PCR參數(shù)為95℃15 min；95℃5 s、56℃20 s、72℃30 s，共50個(gè)循環(huán)；72℃30 s［4］。

1.2.3 Apo E基因型檢測 引物序列為：5′－ACAGAATTCGCCCCGGCCT GGTACAC－3′和5′－TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA－3′。PCR 參數(shù)為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、70 ℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；70℃5 min［5］。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，銀染后Gel－Doc 2000下照相分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用H WJ軟件進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡估計(jì)，其他統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 11.5軟件完成。用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因和等位基因型頻率，各組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各基因組Hardy－Weinberg平衡吻合度檢測

除LOAD組rs6656401以外，對(duì)照組和LOAD組病人中其他SNP位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy－Weinber g平衡法則（P＞0.05）。

2.2 兩組臨床特征比較

LOAD組和對(duì)照組的年齡、性別無明顯差異（P＞0.05）。LOAD 組攜帶 Apo Eε4等位基因者120例，對(duì)照組攜帶Apo Eε4等位基因者84例，攜帶Apo Eε4等位基因可增加LOAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（χ2＝5.52，P＜0.05，OR＝2.91，95%CI＝2.06～4.12）。

2.3 兩組rs6656401和Apo E等位基因和基因型頻率分布

LOAD組與對(duì)照組CR1基因rs6656401的基因型和等位基因頻率差異有顯著意義（χ2＝6.56、7.16，P＜0.05），等位基因A顯著增加了LOAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR＝2.60，95%CI＝1.13～5.98）。這一顯著性差異在非Apo Eε4攜帶者中依然存在（χ2＝11.78、11.58，P＜0.05），而在 Apo Eε4攜帶者中則未發(fā)現(xiàn)兩組間rs6656401基因型和等位基因頻率差異有顯著性（P＞0.05）。見表1～3。

表1 兩組rs6656401等位基因和基因型頻率分布（例（χ／%））

表2 兩組ApoEε4攜帶者rs6656401等位基因和基因型頻率比較（例（χ／%））

表3 兩組非ApoEε4攜帶者rs6656401等位基因和基因型頻率比較（例（χ／%））

2.4 兩組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率分布

LOAD組與對(duì)照組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率差異無顯著性（P＞0.05）。然而，將該位點(diǎn)經(jīng)是否攜帶Apo Eε4分層后，發(fā)現(xiàn)非Apo Eε4攜帶者中兩組等位基因頻率差異有顯著性（χ2＝4.45，P＜0.05，OR＝1.38，95%CI＝1.02～1.87）。見表4～6。

表4 兩組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率比較（例（χ／%））

表5 兩組ApoEε4攜帶者CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率比較（例（χ／%））

表6 兩組非ApoEε4攜帶者CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率比較（例（χ／%））

2.5 LOAD多因素Logistic回歸分析

經(jīng)過性別、年齡和Apo E調(diào)整以后，CR1基因rs6656401等位基因A攜帶者（基因型AA和AG）較基因型GG純合子導(dǎo)致LOAD的風(fēng)險(xiǎn)高2.40倍（OR＝2.40，95%CI＝1.00－5.73）。而rs3818361基因型TT和CT與CC間的差異則無顯著性（P＞0.05）。

2.6 對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)可能組合的單倍型分析

AT單倍型在LOAD組出現(xiàn)的頻率高于對(duì)照組（χ2＝4.70，P＜0.05，OR＝2.44，95%CI＝1.06～5.62）。見表7。

表7 兩組單倍型頻率比較（例（χ／%））

3 討 論

3.1 Apo E基因與LOAD

業(yè)已證實(shí)，Apo Eε4等位基因被認(rèn)為是LOAD發(fā)病的易感基因［6］，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。但是，Apo Eε4等位基因僅占LOAD發(fā)病獨(dú)立危險(xiǎn)因素的40%～50%［7］。國內(nèi)外的研究不僅證實(shí)此等位基因是LOAD的遺傳易感基因，而且證實(shí)其與其他一些遺傳易感基因存在相互作用［8］。目前，Apo Eε4等位基因已經(jīng)成為LOAD遺傳研究的基本參量［9］。

3.2 CR1基因與LOAD

Aβ是一種異質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，能夠激活補(bǔ)體系統(tǒng)并與C3b結(jié)合。曾經(jīng)有研究認(rèn)為，β蛋白誘導(dǎo)補(bǔ)體激活是AD的重要發(fā)病機(jī)制［10］。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠過度表達(dá)C3能減少Aβ的沉積和病理作用［11］。相反，抑制C3轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)則加速Aβ的沉積和神經(jīng)退行性改變［12］。Aβ通過C3b介導(dǎo)與紅細(xì)胞表面的CR1相結(jié)合，并最終被紅細(xì)胞清除出循環(huán)系統(tǒng)。而CR1作為補(bǔ)體的調(diào)節(jié)劑主要存在于外周血細(xì)胞的細(xì)胞膜中。CR1還存在于外周神經(jīng)有髓鞘纖維的施萬細(xì)胞內(nèi)，并推測其通過限制補(bǔ)體激活而阻止有髓鞘纖維脫髓鞘改變［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性的CR1具有治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病的作用。因此，我們推測CR1在AD發(fā)病中具有保護(hù)作用。

雖然本研究中rs3818361和rs6656401位點(diǎn)均位于CR1的內(nèi)含子中不能直接參與調(diào)整蛋白的表達(dá)，但是此內(nèi)含子基因的突變可能通過影響CR1基因的表達(dá)而導(dǎo)致LOAD的發(fā)病。

最近 LA MBERT 等［3］的研究結(jié)果顯示，CR1的基因多態(tài)性是高加索人患AD的重要基因危險(xiǎn)因素，rs6656401和rs3818361的等位基因是LOAD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，尤其是rs6656401。另外一項(xiàng)基因組研究顯示，rs3818361是歐洲和美洲人群發(fā)生AD的危險(xiǎn)因素［14］。本研究結(jié)果顯示，rs6656401基因多態(tài)性與LOAD發(fā)病有關(guān)，rs6656401的A等位基因與G等位基因聯(lián)合能增加LOAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，此結(jié)論與LA MBERT等的研究結(jié)論相一致。但本研究未顯示rs3818361的等位基因與LOAD發(fā)病有關(guān)。LOAD組與對(duì)照組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率分布也沒有顯著性差異。用是否攜帶Apo Eε4分層后，發(fā)現(xiàn)非Apo Eε4攜帶者中LOAD組rs6656401的A等位基因和rs3818361的T等位基因出現(xiàn)的頻率較對(duì)照組高。這些情況均與LA MBERT等的研究結(jié)果不同，考慮可能與種族不同有關(guān)。本研究結(jié)果還表明，AT單倍型是LOAD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，CR1基因突變可能通過影響Aβ的清除而導(dǎo)致LOAD發(fā)病，rs6656401的A等位基因是漢族人患LOAD的重要危險(xiǎn)因素。

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