鄧 龍 尹大川 鄧 勛 宋瑞清*

(1.黑龍江省林科院，哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040)

苗木立枯病(seedlingdamping-off)又稱苗木猝倒病，由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起。是苗圃普遍發(fā)生、危害嚴重的苗期病害，主要發(fā)生在1～3a生苗木上，特別是出苗1月以內(nèi)、未木質(zhì)化的苗木受害最重[1]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中資源豐富的拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應性強和多機制性的特點[2]。首先,木霉菌競爭作用強,它能迅速生長,進行營養(yǎng)和空間位點的競爭。它能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類次生代謝產(chǎn)物, 如木霉素、膠霉素、綠色木霉素和抗菌肽等,對多種病原菌有抑制作用；此外還具有重寄生作用,通過胞外酶破壞病原菌細胞壁，削弱病原菌的生長勢,甚至殺死病原菌。目前世界范圍內(nèi)有多個以木霉為主要成分的生物殺菌劑，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[3]。同時，木霉還具有促進植物生長、提高抗逆性的作用[4]。本研究利用木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌進行室內(nèi)外生測，為進一步研究木霉對苗木立枯病菌的抑菌機理并開發(fā)具有較高穩(wěn)定性的生物農(nóng)藥奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

(1)木霉菌株：菌株TC-14，保存于東北林業(yè)大學森林微生物研究中心。

(2)病原菌株：苗木立枯病菌—立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，保存于東北林業(yè)大學林學院森林微生物研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株TC-14對苗木立枯病菌的抑制效果

(1)菌株對苗木立枯病菌的拮抗作用。

采用平板對峙培養(yǎng)法[5]。在PDA平板培養(yǎng)基上，相距5cm分別接種直徑0.5cm木霉菌株和病原菌株菌餅。以木霉菌株和病原菌株單獨培養(yǎng)作為對照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理3次重復。每8h測量一次菌落半徑。計算被抑制率、菌絲生長速度和相對抑制效果，觀察拮抗線有無，統(tǒng)計競爭系數(shù)。

對峙培養(yǎng)中競爭系數(shù)分級標準見表1。

表1 菌株對峙培養(yǎng)中競爭系數(shù)分級標準

被抑制率(%)=(對照菌落直徑-對峙培養(yǎng)菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

(2)非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對立枯病菌的抑制作用。

非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物制備：無菌條件下，用0.5cm打孔器切取PDA平板培養(yǎng)基上生長3d的木霉菌落，接種到在300mL PD培養(yǎng)基中，每瓶3片。恒溫振蕩培養(yǎng)(25℃，150r/min)7d。8層紗布過濾后，取濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10，備用。

抑菌活性測定：采用生長速率法。將非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中，搖勻，使終濃度達到20%，倒平板，待冷卻凝固后，接入病原菌，以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板培養(yǎng)作為對照，25℃恒溫培養(yǎng)5d。采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率，每處理3次重復。

1.2.2 木霉菌株TC-14野外應用研究

試驗地位于黑龍江省葦河林業(yè)局西林林場苗圃，供試苗木為落葉松1a生苗木。

TC-14防治菌劑采用濃度為3.5×109/mL的孢子懸浮液和發(fā)酵液原液，分別設置4個濃度梯度，以空白作為對照，采用灌根法進行防治。每個處理1個苗床(1m×20m)，2個重復。2011年5月5日和2011年5月20日防治2次。防治30d后(6月20日)調(diào)查防治效果以及苗木株高。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株TC-14對立枯病菌的抑制效果

2.1.1 拮抗效果

對峙培養(yǎng)48h后，菌株TC-14對3種立枯病菌生長的相對抑制效果均超過1(表2，圖1)。木霉菌株生長速度快，競爭系數(shù)高，在同苗木立枯病菌的對峙培養(yǎng)中，迅速占領生態(tài)位，最終覆蓋病原菌或形成較為明顯的拮抗線，病原菌在木霉菌的作用下幾乎停止生長，并最終被木霉菌所覆蓋。

表2 木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌的抑制效果

2.1.2 次生代謝產(chǎn)物抑菌效果

TC-14次生代謝產(chǎn)物對3個病原菌株均有一定的抑制效果(表2，圖2)。其中，對立枯絲核菌的抑菌率最高，為89.26%。病原菌在平板上菌絲稀疏，生長明顯變?nèi)跎踔敛簧L。該結果與前面的對峙實驗結果相吻合。

2.2 木霉菌株TC-14的野外應用效果

利用木霉菌株TC-14制作的菌劑(孢子粉劑和液體菌劑)對苗木立枯病具有顯著的控制效果(表3)，各菌劑防治效果均接近或高于80%。不同濃度梯度菌劑的防治效果存在一定的差異。孢子粉劑防治效果高于液體菌劑。TC-14孢子粉劑10倍液對苗木立枯病防治效果達到88.6%。

表3 木霉菌劑野外防治效果

木霉菌株TC-14孢子懸浮液和液體菌劑對落葉松苗木的生長均有不同程度的促進作用(圖3)。灌根30d后，液體菌劑10倍液對落葉松苗木高生長促進效果最高，與對照相比高生長提高30.2%。兩種劑型的50倍液對苗木生長均表現(xiàn)出抑制。

3 結論

通過木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌的室內(nèi)外生物測定結果，得出以下結論：菌株TC-14對立枯病菌有一定的拮抗作用，非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中含有高效抑菌活性成分，對立枯病菌具有明顯的控制效果。TC-14孢子懸浮液10倍液野外防治效果最好，液體菌劑10倍液對落葉松苗木高生長促進效果顯著。

參考文獻：

[1]馬存世,劉正祥.針葉苗木立枯病綜合防治技術[J].甘肅科技，2006，22(9)：221～222.

[2]朱廷恒，邢小平，孫順娣.木霉T97菌株對幾種植物病原真菌的拮抗作用機制和溫室防治試驗[J].植物保護學報，2004,31(2)：139～144.

[3]Francesco V., Krishnapillai S., Emilio L. Trichoderma-plant-pathogen interactions[J].Soil Biology & Biochemistry,2008,(40):1～10.

[4]F. Vinale, K. Sivasithamparamb. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2008，(72):80～86.

[5]Morton, D.T., Stroube, N.H. Antagonistic and stimulatory eVects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology,1955,(45):419～420.

[6]宋漳，陳輝.綠色木霉對土傳病原真菌的體外拮抗作用[J].福建林學院學報,2002,22(3):219～222.