楊明蓉, 唐 卓, 陳應(yīng)春

(1. 四川大學(xué) 華西藥學(xué)院,四川 成都 610041; 2. 中國科學(xué)院 成都生物研究所,四川 成都 610041)

近年來，核酸探針雜交技術(shù)在醫(yī)療科研和臨床中被廣泛采用，成為一項直接檢查病原體、癌基因、遺傳病基因突變等的重要手段。用于雜交的核酸探針必須先進行標(biāo)記，可分為同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記兩大類。生物素標(biāo)記的核酸探針屬于非同位素標(biāo)記，它是利用親和素對生物素有極高親和力的原理，分子雜交后用親和素或鏈霉親和素進行檢測[1～4]。生物素標(biāo)記探針穩(wěn)定，不失活，并能配用多種檢測系統(tǒng)，簡單方便。

Richard T Pon[5]設(shè)計合成了一種較為理想的生物素標(biāo)記試劑——[1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二異丙基亞磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基側(cè)鏈顯著增加了生物敏感性[6]，同時3中的二甲氧三苯基增加了穩(wěn)定性，不僅有利于寡核苷酸鏈的合成與純化，而且還可以在DNA合成儀上通過顏色變化檢測連接效率。

為了推進3的應(yīng)用，本文改進文獻[5]方法，先將生物素與DMTrCl(4,4′-二甲氧基三苯基氯甲烷)反應(yīng)制得1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)生物素(1); 1與6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中縮合制得1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2); 2與磷試劑2-氰乙氧基-雙(N,N-二異丙基)亞磷酰胺(Ⅰ)[7]反應(yīng)合成了3(Scheme 1)，總收率51.0%,其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR,31P NMR和MS確證。

改進方法將文獻[5]路線由5步簡化為3步，提高了生物素的轉(zhuǎn)化率,同時避免了昂貴的硅試劑及TBAF(四丁基氟化銨)的使用。

為了驗證改進方法的可行性，本文還采用固相亞磷胺三酯法，應(yīng)用3合成了一段含有十個堿基的5′-端Biotin標(biāo)記的寡核苷酸鏈Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(記為Biotin-A10)[8～11]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確證。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Yanaco型顯微熔點儀(溫度計未校正);Brucker-600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))；Alltech HPLC 1500型液相色譜儀(HPLC); Bruker Daltonics ESI-Bio TOF-Q型高分辨質(zhì)譜儀;ABI 394型DNA合成儀。

硅膠300目～400目，其余所用試劑均為分析純;反應(yīng)均在無水條件下進行，所用試劑都需作無水處理。

1.2 合成

(1)1的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入生物素2 g(8.2 mmol)的吡啶(40 mL)溶液, DMTrCl 8.32 g(24.6 mmol), Et3N 828 mg(8.2 mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶) 250.4 mg(2.08 mmol),攪拌下于70 ℃反應(yīng)4 h。濃縮后用氯仿稀釋，分液，有機相用5%檸檬酸鈉溶液洗滌三次，無水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=3 ∶97]純化得橙紅色固體13.36 g,收率75.0%;1H NMR(DMSO-d6)δ: 1.43～1.64(m, 6H, CH2), 2.16～2.19(m, 4H, SCH2, COCH2), 3.11(m, 1H, SCH), 3.72(s, 6H, OCH3), 4.27～4.33(m, 2H, NCH), 6.70(s, 1H, NH), 6.84(d, 4H, ArH), 7.22(m, 9H, ArH), 11.94(s, 1H, CO2H)。

(2)2的合成

在圓底燒瓶中加入11.65 g(3.02 mmol)的THF(16 mL)溶液和Et3N 306 mg(3.02 mmol),攪拌下于0 ℃緩慢滴加氯甲酸乙酯654 mg(6.04 mmol),滴畢，反應(yīng)1 h;冷卻至-20 ℃，加入6-氨基-1-己醇608 mg(6.04 mmol),反應(yīng)過夜。加水稀釋后用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶20]純化得白色固體21.56 g,收率79.3%;1H NMRδ: 1.24～1.70(m, 14H, CH2), 2.15(t, 2H, NCH2), 2.25～2.60(m, 2H, COCH2), 3.08～3.23(m, 3H, CHS), 3.60(t, 2H, OCH2), 3.80(s, 6H, OCH3), 4.36(m, 2H, NCH), 5.10(s, 1H, NH), 5.63(s, 1H, NH), 6.81(d, 4H, ArH), 7.22(m, 9H, ArH)。

(3)3的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入2645 mg(1 mmol)的無水乙腈(10 mL)溶液，四氮唑140 mg(2 mmol), DIPA(N,N-二異丙胺)242.3 mg(2.4 mmol)和Ⅰ 600 mg(2 mmol),攪拌下于室溫反應(yīng)2 h。用二氯甲烷(200 mL)稀釋，分液，有機相依次用5%碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(Et3N) ∶V(氯仿)=1 ∶19]純化得白色固體3724 mg,收率85.7%, m.p.148 ℃～150 ℃;1H NMRδ: 1.21(m, 12H, CH3), 1.24～1.90(m, 14H, CH2), 2.17(t, 2H, NCH2), 2.22～2.60(m, 2H, COCH2), 2.65(t, 2H, CH2CN), 3.08～3.30(m, 3H, CHS), 3.53～3.78(m, 4H, OCH2), 3.80(s, 6H, OCH3), 4.35(m, 2H, CHN), 5.13(s, 1H, NH), 5.61(s, 1H, NH), 6.81(d, 4H, ArH), 7.22(m, 9H, ArH);13C NMRδ: 11.44, 24.55, 24.60, 24.66, 25.23, 25.61, 26.63, 29.50, 39.31, 42.96, 43.01, 46.20, 54.41, 55.23, 58.20, 59.66, 65.40, 72.74, 112.79, 117.77, 126.86, 127.48, 129.74, 131.30, 135.83, 135.91, 143.86, 158.39, 161.81, 172.92;31P NMRδ: 147.81(s); ESI-MSm/z: 868{[M+Na]+}。

1.3 3在合成DNA中的應(yīng)用

在反應(yīng)瓶中加入0.1 mol·L-13的乙腈溶液,置DNA合成儀上，在一段含10個A堿基的寡核苷酸鏈(A10)的5′-端連接3；其N-DMT(N-上的4,4′-二甲基三苯基甲基保護基)經(jīng)5%三氯乙酸/二氯甲烷脫去后于55 ℃氨解10 h。經(jīng)反相HPLC純化(條件見表1)得目標(biāo)序列Biotin-A10; ESI-MSm/z: 3 474。

表 1 Biotin-A10的反相HPLC純化條件*Table 1 Purification conditions of reversed-phase HPLC for Biotin-A10

*Apollo C18柱(4.6 m×250 mm, 5 μm);柱溫30 ℃;檢測波長260 nm;流動相A: Et3N·AcOH buffer(pH 7.0),流動相B:乙腈,流速1.0 mL·min-1;進樣量20 μL; tA10=17.86 min, tBiotin-A10=21.44 min

2 結(jié)果與討論

本文以文獻[5]工作為基礎(chǔ)，改進合成3的方法。由1合成2采用混合酸酐法，利用氨基與羥基反應(yīng)活性的差異一步生成酰胺，避免了羥基的保護與脫保護，簡化了反應(yīng)步驟。

由2合成3選用Ⅰ為磷試劑比2-氰基乙氧基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺(Ⅱ)[5]的穩(wěn)定性更好、后處理方便、且原料轉(zhuǎn)化率高，3總收率達51.0%。此外，Ⅰ可大量合成，相對于昂貴的Ⅱ成本大大降低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

本文將3應(yīng)用于合成DNA,成功地制得Biotin-A10，充分顯示了3在合成DNA中的廣闊應(yīng)用前景。

為了提高生物素的轉(zhuǎn)化率，DMTrCl, 6-氨基-1-己醇， Ⅰ均要過量;因為Ⅰ易被氧化，由2合成3應(yīng)在氮氣保護下進行。

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