李勇 賴潤龍 譚殿輝 陳煜 雷霆

細胞周期檢測點激酶1，2(checkpoint kinase 1，2，即Chkl，Chk2)位于細胞周期檢測點激活徑路的終端，是細胞周期檢測中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白激酶［1］。由于目前國內(nèi)外關(guān)于Chk1和Chk2在膠質(zhì)細胞瘤組織中實際表達狀況的報道很少，本研究采用免疫組織化學法檢測Chk1、Chk2蛋白在不同膠質(zhì)瘤組織和正常對照組織中的分布特點，以探討Chk1、Chk2作為膠質(zhì)瘤治療靶點的合理性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2005年5月至2011年8月我院病理科存檔處已確診腦膠質(zhì)瘤組織標本80例，其中男44例，女36例，年齡6～68歲，平均(39.7±8.4)歲。參照 WHO(2000年)膠質(zhì)瘤分類及分級標準，其中髓母細胞瘤12例，室管膜瘤9例，少枝膠質(zhì)細胞瘤16例，星形細胞瘤43例(其中多形性膠質(zhì)母細胞瘤12例);WHOⅠ～Ⅱ級46例，WHOⅢ～Ⅳ級34例。通過內(nèi)減壓手術(shù)獲得正常腦組織標本18例作為對照，其中男11例，女7例，年齡18～54歲，平均(32.5±6.5)歲。所有患者術(shù)前均無放療、化療史。組織經(jīng)10% 福爾馬林液固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，先經(jīng)HE染色，病理科醫(yī)師光鏡復(fù)查證實病理診斷后，再行免疫組化染色。

1.2 方法 所取組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片。采用免疫組織化學鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶法(Strept-avidin-biotin complex，SABC)染色，以磷酸鹽緩沖液，Phosphate balanced solution，PBS)代替一抗作為陰性對照。參照Consantine等［2］的標準，高倍鏡(400)下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準:不著色0分;黃色1分;棕黃色2分;黃褐色3分。陽性細胞所占比例評分標準:陽性細胞數(shù) ＜10%者0分;10% ～40%者1分;40% ～70%者2分;≥70%者3分。兩種評分相乘，結(jié)果記為免疫組化評分值，以均數(shù)±標準差表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學處理采用SPSS for windows Ver.13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗、方差分析和Peason's相關(guān)分析。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

Chk1、Chk2蛋白在各類型膠質(zhì)瘤和正常腦組織中均表達，陽性細胞表達定位在細胞核及細胞質(zhì)，并以細胞核為主(見圖1 A～F)。Chk1廣泛表達于膠質(zhì)瘤細胞中，棕黃色染色較強，而正常腦組織中染色普遍較弱。膠質(zhì)瘤細胞與正常腦組織相比，Chk1蛋白表達水平有顯著性差異(P=0.027)，Chk2蛋白表達水平經(jīng)統(tǒng)計學分析差異無顯著性意義(P=0.173)。(見表1)。在髓母細胞瘤、室管膜瘤、少枝膠質(zhì)細胞瘤以及星形細胞瘤中，Chk1、Chk2蛋白表達無顯著性差異(P值分別為0.467、0.387)。在星形細胞瘤中，多形性膠質(zhì)母細胞瘤與其他星形細胞瘤相比，Chk1、Chk2蛋白表達無顯著性差異(P值分別為0.274、0.312)。在高級別的膠質(zhì)瘤和低級別的膠質(zhì)瘤中，Chk1、Chk2蛋白表達水平無明顯差異(P值分別為0.301、0.135)。Chk1和Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達呈正相關(guān)(r=0.795，P＜0.001)(圖2)。(見表1)。

圖1 Chk1、Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的陽性表達

3 討論

Sanchez［3］和 Matsuoka 等［4］首先闡述了人 Chk1 和 Chk2基因及其蛋白表達，并發(fā)現(xiàn)Chk1和Chk2普遍存在于人多種組織細胞及腫瘤細胞中，而且在藥物及放射線照射引起的細胞周期阻滯反應(yīng)中，Chk1和Chk2發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，U87 mG神經(jīng)膠質(zhì)瘤［5］等多種腫瘤組織中均有其表達，并可能與某些腫瘤發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。

Chk1、Chk2是ATM/ATR(ATM相關(guān)基因)的下游效應(yīng)基因，位于細胞周期檢測點激活徑路的終端，通過調(diào)控Cdc25(A、B、C)、Wee1、P53 等效應(yīng)蛋白，激活 DNA 損傷檢測點［1］。在本研究中，通過免疫組織化學觀察不同膠質(zhì)瘤組織中Chk1、Chk2蛋白的分布發(fā)現(xiàn)，Chk1和 Chk2蛋白在所有類型的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中均表達，陽性細胞表達定位在細胞核及細胞質(zhì)，并以細胞核為主，這種分布可能與Chk1和Chk2能夠識別DNA損傷、參與一系列核內(nèi)磷酸化反應(yīng)的功能有關(guān)。膠質(zhì)瘤細胞中，Chk1蛋白表達水平明顯高于與正常腦組織，而Chk2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達無明顯差別。這提示，從相對意義上而言，Chk1是一種腫瘤特異性表達蛋白，Chk1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。由于Chk1在膠質(zhì)瘤中的顯著高表達，因此可以作為膠質(zhì)瘤治療的靶點，而Chk2在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用有待更進一步 的研究。

表1 Chk1、Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達

圖2 Chk1和Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中表達的相關(guān)性(r=0.795，P ＜0.001)

放射治療是膠質(zhì)瘤綜合治療的重要手段之一，不同病理類型的膠質(zhì)瘤其放射敏感性亦不同，一般認為由高到低依次為髓母細胞瘤、少枝膠質(zhì)細胞瘤、室管膜瘤、星形細胞瘤及膠質(zhì)母細胞瘤［6］。本研究中，發(fā)現(xiàn)Chk1、Chk2蛋白的表達水平與膠質(zhì)瘤病理類型無關(guān)，這提示，Chk1、Chk2蛋白的表達與膠質(zhì)瘤的放射敏感性并無相關(guān)性，Chk1、Chk2蛋白表達水平不能作為膠質(zhì)瘤對放療抗拒的判定指標。在病理分級上，Chk1、Chk2蛋白的表達水平在高級別的膠質(zhì)瘤和低級別的膠質(zhì)瘤中無明顯差異，可見Chk1、Chk2蛋白與膠質(zhì)瘤的病理分級無關(guān)。這說明Chk1、Chk2蛋白不能作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標。

Chk1和Chk2是目前被認為在細胞周期檢測點中起重要作用的激酶，但對Chk1和Chk2在細胞周期檢測點中的作用有不同的認識。Shigeishi［7］認為Chk1和Chk2在胃癌中表達水平與P53蛋白表達水平有明顯相關(guān)性，但Chk1和Chk2之間表達無相關(guān)性。Chk1的抑制劑UCN-O1處理細胞后不僅增加P53表達的細胞對TMZ的敏感性，而且阻斷TMZ誘導(dǎo)的Chk1活化和短暫的G2/M阻滯，從而增加細胞凋亡［5］。在P53缺失的細胞中，抑制Chk1同樣可增加細胞對放射線的敏感性［8］。這些提示Chk1可能參與腫瘤耐藥，但同樣的研究表明Chk2不能明顯增加腫瘤細胞的凋亡［9］。本研究中發(fā)現(xiàn)，Chk1與Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達呈正相關(guān)，這說明Chk1、Chk2蛋白在DNA損傷檢測點激活可能具有協(xié)同作用。

［1］Sanchez Y，Wong C，Thoma RS，et al.Conservation of the CHK1 checkpoint pathway in mammals:linkage of DNA damage to CDK regulation through Cdc25.Science，1997，277(5331):1497-1501.

［2］Constantine A，Monteagado O，Merino HJ，et al.Immunohistochemical detection of P-glycoprotein in endometrial adenocarcinoma.Am J Pathol，1991，138:799-806.

［3］Sanchez Y，Wong C，Thoma RS，et al.Conservation of the CHK1 checkpoint pathway in mammals:linkage of DNA damage to CDK regulation through Cdc25.Science，1997，277(5331):1497-1501.

［4］Matsuoka S，Huang M，Elledge SJ.Linkage of ATM to cell cycle 39 regulation by the CHK2 protein kinase.Science，1998，282(5395):1893-1897.

［5］Hirose Y，Berger MS，Pieper RO.Abrogation of the CHK1-mediated G(2)checkpoint pathway potentiates temozolomide-induced toxicity in ap53-independent manner in human glioblastoma cells.Cancer Res，2001，61(15):5843-5849.

［6］吳承遠，劉玉光.臨床神經(jīng)外科學.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:233-248.

［7］Shigeishi H，Yokozaki H，Oue N，et al.Increased expression of CHK2 in human gastriccarcinomas harboring p53 mutations.Int J Cancer，2002，99:58.

［8］Zenvirt S，Kravchenko-Balasha N，Levitzki A.Status of p53 in human cancer cells does not predict efficacy of CHK1 kinaseinhibitors combined with chemotherapeutic agents.Oncogene，2010，29:6149-6159.

［9］Yeh Y，Huang Y，Lin TY，et al.The cell cycle checkpoint kinase CHK2 mediatesDNA damage-induced stabilization ofTTK/hMps1.Oncogene，2009，28(10):1366-1378.