苗麗君 張瑞霞 王 靜 蔣軍廣 韓雪萍 張水軍 孫振濤

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450052)

降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)腦死亡大鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響

苗麗君 張瑞霞 王 靜 蔣軍廣 韓雪萍1張水軍2孫振濤1

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450052)

目的 觀察腦死亡大鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)以及降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)干預(yù)處理對(duì)腦死亡大鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響。方法 健康Wistar大鼠15只，隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組(A組)、腦死亡組(B組)及CGRP處理組(C組)，每組5只。A組持續(xù)麻醉維持12 h。B組通過(guò)呼吸、循環(huán)支持維持大鼠腦死亡狀態(tài)12 h。C組于腦死亡模型建立成功后靜脈輸注CGRP 3 μg/kg，隨后給予CGRP 6 μg/kg持續(xù)輸注維持12 h，維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦死亡狀態(tài)12 h。于腦死亡后12 h取肺臟組織，檢測(cè)MDA含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性及肺組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 肺組織中MDA含量B組高于A組及C組(P＜0.05)，肺組織SOD活性C組高于B組及A組(P＜0.05)，肺組織γ-GCS mRNA水平C組＞B組＞A組，γ-GCS蛋白水平C組＞A組＞B組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。結(jié)論 腦死亡可導(dǎo)致大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化能力減弱;CGRP可增高腦死亡大鼠肺組織γ-GCS蛋白水平，增高抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

腦死亡;肺;氧化應(yīng)激;降鈣素基因相關(guān)肽

腦死亡供體的器官保護(hù)已經(jīng)成為器官移植技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，有效的器官保護(hù)不僅可以提高移植后器官的成活率，也能加快器官功能的恢復(fù)，腦死亡供體器官損傷的機(jī)制及防護(hù)已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)氧化應(yīng)激在肺損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用〔1～3〕。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)有血管舒張作用，心肌正性變力、變時(shí)作用，缺血再灌注損傷保護(hù)作用等多種生物學(xué)功能〔4〕。本實(shí)驗(yàn)擬在建立大鼠腦死亡模型基礎(chǔ)上，檢測(cè)肺組織中氧化應(yīng)激(OS)水平的改變，以及CGRP干預(yù)處理對(duì)腦死亡大鼠肺組織OS的影響，為腦死亡后的肺保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

健康Wistar大鼠15只，雌雄不限，體重250～300 g，SPF級(jí)，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。肌內(nèi)注射阿托品0.03 mg/kg，10%的水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉。麻醉后，行股動(dòng)靜脈插管、氣管內(nèi)插管，開(kāi)顱后顱內(nèi)放置Foley氣囊導(dǎo)管。隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(A組)、腦死亡組(B組)與CGRP組(C組)，每組5只。A組持續(xù)麻醉維持12 h，不建立腦死亡模型，12 h后撤除麻醉，動(dòng)物蘇醒后處死。B組大鼠參照文獻(xiàn)〔5～7〕，在球囊導(dǎo)管內(nèi)逐漸緩慢注入生理鹽水行顱內(nèi)加壓，加壓速度約為0.1 ml/min，直至達(dá)到腦死亡狀態(tài);大鼠呼吸停止后，將氣管導(dǎo)管接Harvard Inspira ASV動(dòng)物呼吸機(jī)，機(jī)控呼吸，設(shè)定呼吸機(jī)參數(shù)為：潮氣量為8.0 ml/kg，呼吸頻率為60次/min;維持平均動(dòng)脈壓在正常范圍(60 mmHg以上)，必要時(shí)根據(jù)情況使用多巴胺及血管加壓素等血管活性藥物;腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為：瞳孔散大固定，無(wú)角膜反射、對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)、腦干反射消失、呼吸停止、靜息腦電圖〔8〕;通過(guò)呼吸、循環(huán)支持維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦死亡狀態(tài)12 h;12 h后撤除呼吸、循環(huán)支持，動(dòng)物心肺死亡。C組為CGRP干預(yù)的腦死亡組，同樣采用緩慢顱內(nèi)加壓法建立大鼠腦死亡模型;于腦死亡模型建立成功后經(jīng)靜脈用微量輸注泵給予 CGRP 3 μg/kg(30 min內(nèi)輸注完畢)，隨后給予CGRP 6 μg/kg持續(xù)輸注維持12 h〔9〕，CGRP 購(gòu)自 Sigma 公司。

1.2 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

在腦死亡12 h時(shí)點(diǎn)留取肺組織，硫代巴比妥鈉法測(cè)定肺勻漿中丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，MDA、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。采用RT-PCR方法檢測(cè)肺組織中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA水平。γ-GCS引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成：上游引物為：5'-TAA TCT TGC CTC CTG CTG T-3';下游引物為：5'-CTT CCT GGA AAC TTG CCT C-3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為122 bp。退火溫度52℃。內(nèi)參GAPDH引物：上游引物為：5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3';下游引物為：5'-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為568 bp。退火溫度58℃。產(chǎn)物置于20 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠圖像分析儀下測(cè)目的基因及內(nèi)參照吸光度值并攝像，將內(nèi)參引物GAPDH的吸光度值設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)1，γ-GCS與其所對(duì)應(yīng)的GAPDH比為標(biāo)準(zhǔn)值(相對(duì)表達(dá)量)即為最后的γ-GCS基因相對(duì)含量。采用免疫印跡方法測(cè)肺組織γ-GCS蛋白表達(dá)，暗室曝光顯色后拍照，然后掃描至計(jì)算機(jī)，使用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算待測(cè)條帶的吸光度×面積，與其內(nèi)參照的吸光度×面積的比值作為其蛋白質(zhì)表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。γ-GCS抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織MDA含量及SOD活性

組高于A組及C組，C組高于A組(均P＜0.05)，肺組織SOD活性B組低于A組及C組(均P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠肺組織 γ-GCS mRNA及蛋白表達(dá)比較

肺組織γ-GCS mRNA水平B組、C組均較A組升高，C組較B組升高(均P＜0.05)。肺組織γ-GCS蛋白水平B組較A組降低，C組較B組、A組增高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。見(jiàn)表 1、圖 1、圖 2。

肺組織中MDA含量B

表1 各組動(dòng)物肺組織中MDA含量、SOD活性、γ-GCS mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(n=5s)

表1 各組動(dòng)物肺組織中MDA含量、SOD活性、γ-GCS mRNA及蛋白表達(dá)水平比較(n=5s)

與A組比較：1)P＜0.05;與B組比較：2)P＜0.05

組別MDA(μmol/g prot)SOD(kU/g prot) γ-GCS mRNA γ-GCS 蛋白A組 1.12±0.41 129.48±11.792)0.17±0.01 0.05±0.01 B組 3.78±0.471) 103.27±13.82 0.19±0.011) 0.03±0.011)C組2.68±0.511)2)137.58±12.652)0.32±0.041)2)0.11±0.031)2)

圖1 各組γ-GCS mRNA水平

圖2 各組γ-GCS蛋白表達(dá)水平

3 討論

腦死亡后肺組織中MDA含量升高及SOD活性水平下降，說(shuō)明腦死亡后OS反應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化能力減弱。OS本質(zhì)是機(jī)體的一種基本的自我保護(hù)機(jī)制，參與體內(nèi)炎癥、免疫、增殖、細(xì)胞再生、修復(fù)等多種重要生命過(guò)程的調(diào)節(jié)。OS多發(fā)生在機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)，正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)平衡，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，如SOD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶等，可以及時(shí)快速清除體內(nèi)過(guò)剩的ROS。如果氧化應(yīng)激反應(yīng)失控，抗氧化酶表達(dá)不足，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，抗氧化作用不足而氧化作用過(guò)強(qiáng)，就極可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織發(fā)生不同程度損傷〔10～12〕。腦死亡作為一種嚴(yán)重的傷害性刺激，啟動(dòng)了機(jī)體的氧化應(yīng)激系統(tǒng)，導(dǎo)致腦死亡大鼠肺組織氧化和抗氧化平衡發(fā)生了改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦死亡大鼠γ-GCS mRNA水平升高但γ-GCS蛋白水平下降，說(shuō)明腦死亡應(yīng)激后的γ-GCS mRNA水平較對(duì)照組有一定程度代償性升高，mRNA和蛋白水平是一個(gè)相偶聯(lián)的過(guò)程，但是兩者沒(méi)有必然一致的趨勢(shì)，細(xì)胞核相應(yīng) mRNA的合成速度，細(xì)胞質(zhì)相應(yīng)mRNA的降解速度對(duì)蛋白的濃度都會(huì)產(chǎn)生影響，可能因?yàn)榭寡趸鞍酌甫?GCS耗竭大于生成，所以γ-GCS蛋白水平下降。γ-GCS是核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)驅(qū)動(dòng)的靶基因〔13〕，是受Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的抗氧化蛋白之一〔14〕，而Nrf2具有多器官保護(hù)作用〔15〕，如Nrf2可通過(guò)增加解毒和抗氧化能力保護(hù)肺臟抵御二丁基羥基甲苯誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、高氧損傷和博來(lái)霉素介導(dǎo)的肺纖維化〔16〕。谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化劑，對(duì)糾正氧化失衡，保護(hù)肺組織免受氧化損傷起關(guān)鍵作用;對(duì)保持氣道上皮細(xì)胞完整性，抵御肺部損傷與炎癥等方面非常重要〔17〕。內(nèi)源性谷胱甘肽主要存在于胞漿內(nèi)，γ-GCS是其合成的關(guān)鍵限速酶，調(diào)控GSH生成的速度和量〔18〕。γ-GCS蛋白表達(dá)降低，谷胱甘肽合成減少，就會(huì)導(dǎo)致局部肺組織氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡〔19〕。γ-GCS表達(dá)上調(diào)，抗氧化作用增強(qiáng)則對(duì)肺組織損傷有保護(hù)作用〔20〕。

CGRP是一種由辣椒素敏感的感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，在體內(nèi)有廣泛的分布和表達(dá)，有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用、肺損傷保護(hù)作用等多種生理功能。CGRP作為神經(jīng)元鈣調(diào)蛋白依賴(lài)激酶cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)p38 MAPKNF-κB級(jí)聯(lián)反應(yīng)。另外，CGRP可能通過(guò)抑制p38 MAPK磷酸化抑制H2O2誘導(dǎo)的Nox4表達(dá)，進(jìn)而降低強(qiáng)活性氧的產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的作用〔10〕。Schaeffer等〔11〕的研究還表明：CGRP 是通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK，ERK1/2和P38的蛋白激酶的激活拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)顯示腦死亡大鼠γ-GCS蛋白表達(dá)水平下降，機(jī)體抗氧化保護(hù)功能下降，促進(jìn)了腦死亡后肺損傷的發(fā)展，采用CGRP干預(yù)治療后腦死亡大鼠體內(nèi)抗氧化物酶γ-GCS水平上升、SOD活力顯著升高，表明CGRP可能通過(guò)升高γ-GCS水平促進(jìn)機(jī)體抗氧化功能的升高而起到肺保護(hù)作用。

綜上所述，腦死亡可導(dǎo)致大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，CGRP可通過(guò)升高γ-GCS水平抑制腦死亡大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。

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R56

A

1005-9202(2012)23-5186-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.039

河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新人才工程項(xiàng)目(4088);河南省醫(yī)學(xué)科技重大攻關(guān)項(xiàng)目(200902019)

1 本院麻醉科 2 本院外科

蔣軍廣(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事呼吸疾病的基礎(chǔ)及臨床研究。

苗麗君(1970-)，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，在讀博士，主要從事呼吸疾病的基礎(chǔ)及臨床研究。

〔2012-06-25收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曲 莉)