賈連群 楊關林 任 路 馮峻屹 陳 陽 崔 勇 (遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 0847)

化瘀祛痰方藥及其拆方對內(nèi)皮細胞TLR4/NF-κB炎癥信號通路干預的研究

賈連群 楊關林 任 路 馮峻屹 陳 陽1崔 勇 (遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847)

目的 探討化瘀祛痰方藥及其拆方含藥血清對脂多糖(LPS)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926 TLR4/NF-κB信號通路活化的干預作用。方法 40只SD大鼠隨機分為5組，即空白對照組、全方組、補氣組、化瘀組、祛痰組，各組大鼠分別以生理鹽水和相應中藥煎劑連續(xù)灌胃9 d，末次灌胃給藥2 h后，腹主動脈采血，離心后分離血清。體外培養(yǎng)EA.hy926細胞，隨機分為7組，即①正常對照組、②LPS刺激組、③全方組、④補氣組、⑤化瘀組、⑥祛痰組、⑦空白血清對照組。其中②組加入終濃度為10 μg/ml的LPS，③～⑦組用各組含藥血清(濃度為10%)預處理24 h后加入終濃度為10 μg/ml的LPS，各組細胞培養(yǎng)24 h后進行各項指標測定。采用實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Real-time PCR)定量分析TLR4、NF-κB和TNF-α mRNA表達;ELISA法檢測TNF-α含量;Western印跡檢測TLR4、NF-κB蛋白表達。結(jié)果 與正常對照組相比，LPS刺激后TLR4、NF-κB和TNF-α表達顯著增加(P＜0.01)，全方組TLR4、NF-κB和 TNF-α的表達與刺激組相比顯著減少(P＜0.01);拆方各組中，化瘀組TLR4、NF-κB和TNF-α水平均顯著減少(P＜0.01)，而補氣組和祛痰組TLR4、NF-κB和TNF-α水平降低不明顯。結(jié)論 化瘀祛痰方藥及化瘀拆方可顯著抑制內(nèi)皮細胞TLR4/NF-κB炎癥信號通路的活化，這可能是其抗AS的作用機制之一。

化瘀祛痰;動脈粥樣硬化;炎癥信號通路

大量研究證實，炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化(AS)發(fā)展全過程，在AS病變初始期、發(fā)展期及AS斑塊的破裂等急性病變中炎癥刺激均起著重要作用〔1〕。內(nèi)皮細胞功能障礙是AS形成的早期病變，內(nèi)皮細胞損傷是AS發(fā)生發(fā)展的病理基礎〔2〕。脂多糖(LPS)也稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性細菌誘發(fā)炎癥的主要致病因子。LPS可介導內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞以及單核巨噬細胞等激活，誘導炎癥因子的釋放。目前認為，TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路活化是LPS所導致的細胞反應與炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α，白介素(IL)-6等產(chǎn)生的重要分子機制。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，化瘀祛痰方藥對冠心病不穩(wěn)定型心絞痛具有良好的治療效果〔3〕，動物實驗證實化瘀祛痰方藥能顯著降低AS家兔血漿P-選擇素(Ps)、內(nèi)皮素(ET)-1水平，升高NO水平〔4〕。本實驗研究化瘀祛痰方藥及其拆方對LPS誘導內(nèi)皮細胞TLR4/NF-κB信號通路活化的影響，探討化瘀祛痰方藥治療AS性心血管疾病的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞株

雄性SD大鼠40只，SPF級，體重(300±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2006-0009;人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物制備

化瘀祛痰方(全方)由黨參、黃芪、絞股藍、丹參、茯苓、半夏、菖蒲、川芎、赤芍、郁金組成;補氣方由黨參、黃芪、絞股藍組成;化瘀方由丹參、川芎、赤芍、郁金組成;祛痰方由茯苓、半夏、菖蒲組成，以上藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。各組方藥分別浸泡1 h后，武火煮沸，文火煮20 min，過濾，重復煎3次，合并濾液，濃縮至全方含生藥1.79 g/ml，補氣方含生藥0.75 g/ml，化瘀方含生藥0.54 g/ml、祛痰方含生藥0.42 g/ml，各組煎劑冷卻后4℃保存。

1.3 試劑

DMEM/高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國 Hyclone公司。LPS為美國 Sigma公司產(chǎn)品。SYBRPremixExTaqTM試劑盒、Trizol、瓊脂糖購自TaKaRa公司。ELISA試劑盒購自深圳依諾金生物科技有限公司，Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，蛋白質(zhì)提取試劑盒、SABC試劑盒購自武漢博士德公司，兔抗人TLR4、NF-κB多克隆抗體、二抗羊抗兔HRP-IgG購自美國Santa Cruz公司。ECL化學發(fā)光試劑購自碧云天生物技術公司。其余試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)EA.hy926細胞。每2天換一次液，4～6 d傳代一次，三次傳代后進行實驗。

1.4.2 含藥血清制備 成年雄性SD大鼠40只，隨機分為5組：空白對照組、全方組、補氣組、化瘀組、祛痰組，空白對照組4只，其余每組各9只。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)9 d。動物給藥量為全方組：17.9 g/kg，補氣組：7.5 g/kg、化瘀組：5.4 g/kg、祛痰組：4.2 g/kg，空白對照組灌服等量生理鹽水。大鼠末次灌胃后2 h(灌藥前禁食不禁水12 h)，腹主動脈采血，離心后分離血清，合并同組含藥血清，0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝，-86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 細胞分組及干預 培養(yǎng)的EA.hy926細胞分為以下各組：①正常對照組：僅用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加任何藥物。②LPS刺激組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μg/ml的LPS。③全方組;④補氣組;⑤化瘀組;⑥祛痰組;⑦空白血清對照組。③～⑦組用各組含藥血清(濃度為10%)預處理24 h后加入終濃度為10 μg/ml的LPS。各組細胞培養(yǎng)24 h后進行各項指標測定。

1.4.4 Real-time PCR 法檢測 TLR4、NF-κB、TNF-α mRNA 表達

Trizol處理各組細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，Real-time PCR法檢測 TLR4、NF-κB、TNF-α mRNA 表達。利用 Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，引物均由大連TaKaRa公司合成。正義鏈：5'-AGCTCTGCCTTCACTAC-3'，反義鏈：5'-GATGATACCAGCACGAC-3'，擴增產(chǎn)物長度為191 bp;NF-κB引物序列：正義鏈：5'-GATTTCGTTTCCGTTATGT-3'，反義鏈：5'-TTTGCTGGTCCCACATAG-3'，擴增產(chǎn)物長度為121 bp;TNF-α引物序列：正義鏈：5'-CCATGTCTTTCTACCCTAATC-3'，反義鏈：5'-AGCTGCTCTGTCGGATG-3'，擴增產(chǎn)物長度為 98 bp;β-actin引物序列：正義鏈：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，反義鏈：5'-TGTCACCTTCACCGTTCC-3'擴增產(chǎn)物長度為152 bp。Real-time PCR 擴增程序為：94℃ 預變性 5 min，(94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s)×50循環(huán)，72℃延伸10 min。將逆轉(zhuǎn)錄及PCR終產(chǎn)物置于-20℃保存。用ΔΔCT法對Real-time PCR結(jié)果進行相對定量分析。ΔCT值為目的基因CT值與β-actin的CT值差值，ΔΔCT為各實驗組ΔCT與正常對照組ΔCT差值。平均相對含量=2-ΔΔCT，為相對于正常對照組mRNA的水平。

1.4.5 ELISA法檢測TNF-α含量 各組細胞處理后收集培養(yǎng)液于酶標板，37℃孵育2 h，清洗液洗板300 μl/孔洗板，TNF-α抗體 100 μl/孔 37℃孵育 2 h，洗板，酶結(jié)合物 100 μl/孔 37℃孵育30 min，洗板，分別加顯色液 A 和 B 各 50 μl/孔，37℃ 孵育30 min，終止液100 μl/孔，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度。

1.4.6 Western印跡法檢測TLR4、NF-κB的表達 分別收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒對蛋白進行定量。以60 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至 PVDF膜，加入1∶100兔抗人TLR4、NF-κB一抗，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 000)。按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用5 min后進行X光片曝光。X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 化瘀祛痰方藥及其拆方含藥血清對LPS誘導EA.hy926細胞TLR4、NF-κB和TNF-α mRNA的影響

Real-time結(jié)果表明經(jīng)LPS誘導TLR4、NF-κB和TNF-α的mRNA表達增多，顯著高于正常對照組(P＜0.01)。全方可以顯著抑制TLR4、NF-κB和TNF-αmRNA的表達(P＜0.01)。拆方各組中，補氣、祛痰組TLR4、NF-κB和TNF-αmRNA 的表達也有下調(diào)，但無統(tǒng)計學意義，而化瘀組TLR4、NF-κB和TNF-αmRNA表達顯著下降(P＜0.01)。見表1。

表1 化瘀祛痰方藥及其拆方含藥血清對LPS誘導EA.hy926細胞 TLR4、NF-κB和 TNF-α mRNA 的影響± s，n=3)

表1 化瘀祛痰方藥及其拆方含藥血清對LPS誘導EA.hy926細胞 TLR4、NF-κB和 TNF-α mRNA 的影響± s，n=3)

與正常對照組比較：1)P＜0.01;與LPS刺激組比較：2)P＜0.01

分組 TLR4 mRNA NF-κB mRNA TNF-αmRNA正常對照組1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 LPS刺激組 3.93±0.851) 3.77±0.761) 4.59±1.321)全方組 2.17±0562) 2.21±0.532) 2.68±0.602)補氣組 3.42±0.78 3.35±0.75 3.96±0.87化瘀組 2.35±0.722) 2.41±0.762) 2.94±0.812)祛痰組 3.36±0.72 3.22±0.69 4.02±1.05空白血清對照組3.78±0.79 3.54±0.87 4.23±1.16

2.2 化瘀祛痰方藥及其拆方含藥血清對LPS誘導EA.hy926細胞TNF-α蛋白含量的影響

經(jīng)LPS刺激EA.hy926細胞TNF-α含量較正常對照組明顯升高〔(24.32±10.21)pg/ml vs(5.87±0.45)pg/ml，P ＜0.01〕，全方可顯著抑制 TNF-α 水平〔(17.89±7.74)pg/ml，P ＜0.01〕。拆方各組中，補氣、祛痰組TNF-α 的含量略有減少 〔(23.74 ±9.35)pg/ml，(22.38 ±7.01)pg/ml〕，而 化 瘀 組 TNF-α 含 量 顯 著 下 降 〔(17.41±8.25)pg/ml，P＜0.05〕?？瞻籽鍖φ战M TNF-α 為(23.29±8.23)pg/ml。

2.3 化瘀祛痰方藥及其拆方含藥血清對LPS誘導EA.hy926細胞TLR4、NF-κB表達的影響

Western印跡結(jié)果表明經(jīng)LPS誘導，EA.hy926細胞TLR4、NF-κB的表達增多，全方可明顯抑制 TLR4、NF-κB 的表達，拆方各組中，化瘀組 TLR4、NF-κB 表達下降較為明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 EA.hy926細胞TLR4、NF-κB蛋白表達

3 討論

化瘀祛痰方藥組方具有“補中寓通、補不壅滯、通不損正、氣血并重”的特點。方中重用黨參、絞股藍健脾益氣;配合茯苓既能健脾，又能滲濕，使?jié)駸o所聚，痰無由生;丹參功擅活血祛瘀，為治瘀血阻滯之要藥;佐以石菖蒲、郁金，化痰和胃，活血行氣，使氣機暢通。諸藥合用，共奏益氣祛痰化瘀之功，使瘀化則津液自通，痰邪自散，痰散則脈絡通利，瘀不能生。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，化瘀祛痰方藥抗AS作用涉及調(diào)脂、抗炎、保護內(nèi)皮細胞等諸多方面，本實驗擬從拆方的角度對其抗炎作用的分子生物學機制進行探討。

目前，對AS發(fā)病機制的理解主要包括內(nèi)皮損傷反應、脂質(zhì)浸潤、血小板聚集和血栓形成以及單克隆平滑肌細胞增生等學說。內(nèi)皮損傷反應學說認為AS各種主要危險因素最終都損傷動脈內(nèi)膜，而粥樣硬化病變的形成是動脈內(nèi)膜對損傷作出的炎癥-纖維增生性反應的結(jié)果。血管內(nèi)皮細胞受損和功能減退是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為實驗對象。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，內(nèi)皮細胞TLR4、NF-κB和 TNF-α的表達增加，全方可顯著抑制TLR4、NF-κB和 TNF-α的表達;拆方各組中，化瘀藥對 TLR4、NF-κB和TNF-α的抑制作用明顯，補氣、祛痰藥則作用相對較弱，結(jié)果進一步證實了化瘀祛痰方藥可通過干預TLR4/NF-κB炎癥信號通路活化從而發(fā)揮抗AS作用。拆方研究結(jié)果提示較補氣、祛痰藥而言，化瘀藥具有更明顯的抗炎作用，分析原因可能與其組方成分有關。丹參作為傳統(tǒng)的活血化瘀藥，廣泛應用于心腦血管疾病的防治。丹參酮為丹參的乙醚或乙醇提取物，是丹參的主要有效成分。現(xiàn)代藥理和臨床實踐證明丹參酮具有保護心肌，抗炎、抗氧化損傷、抗AS等多種藥理作用。崔廣智等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可明顯抑制NF-κB的表達，同時增加其抑制因子IκB-α的表達。

Fang等〔6〕檢測了兔AS斑塊中CD40、VCAM-1和IL-1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA處理可以降低斑塊中這些炎癥因子的表達。同時，化瘀方中川芎、赤芍也有抗炎作用，徐浩等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)川芎、赤芍及其有效部位可抑制載脂蛋白E基因缺陷小鼠AS斑塊中炎癥反應，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。

TLR4是天然免疫系統(tǒng)的一種模式識別受體，具有識別外來致病微生物(如LPS)的作用〔8〕。效應細胞受到LPS等因素刺激后，TLR4與其相應配體結(jié)合通過信號轉(zhuǎn)導最終導致NF-κB激活，引起炎癥因子分泌，進而參與AS的發(fā)生、發(fā)展過程，從而在天然免疫與AS之間架起一座橋。目前認為，LPS刺激信號在靶細胞傳導通路可簡要概括為：TLR4→胚胎蛋白MyD88→IL-1受體相關激酶(IRAK)→核因子κB抑制物(I κB) →NF-κB，進而誘導 TNF-α、IL 等的表達〔9〕。上述途徑通常被稱為TLR4/NF-κB信號通路。TNF-α是TLR4/NF-κB信號通路中的下游信號分子，表達量的多少可以直接反映炎癥的嚴重程度。我們發(fā)現(xiàn)化瘀祛痰全方及拆方化瘀藥能顯著下調(diào)LPS誘導的 TLR4、NF-κB、TNF-α 的表達，提示抑制 TLR4/NF-κB信號通路活化可能是化瘀祛痰全方及拆方化瘀藥發(fā)揮抗炎作用進而干預AS發(fā)生、發(fā)展的機制之一。

1 趙 鋼，楊關林，李志明.化瘀祛痰顆粒劑含藥血清對LPS誘導大鼠內(nèi)皮細胞p65表達的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2006;33(5)：624.

2 Ross R.Atheroselerosis is an inflammatory disease〔J〕.Am Heart J，1999;138(5 Pt 2)：S419.

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5 崔廣智，金樹梅，趙桂峰，等.丹參酮ⅡA對TNFα誘導的ECV304細胞 NFκB、IκB-α 表達及黏附分子 ICAM1、VCAM1mRNA 表達的影響〔J〕. 中國藥理學通報，2007;23(12)：1671.

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Effect of Huayuqutan recipe and its separated recipes on TLR4/NF-κB signal pathway in endothelial cells

JIA Lian-Qun，YANG Guan-Lin，REN Lu，et al.
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China

Objective To observe the influence of Huayuqutan recipe and its separated recipes on TLR4/NF-κB signal pathway in cultured human umbilical veins endothelial cells EA.hy926 induced by LPS.Methods 55 SD rats were equally divided into five groups in random：the control，Huayuqutan，Buqi，Huayu，Qutan recipes groups.They were gastric perfused daily with normal saline and decoction respectively.Blood drawn from abdominal aorta of rats 2 h after ending perfusion on the 9th day，and the serum separated(drug-serum)was taken for testing.EA.hy926 cells were cultured equally divided into seven groups in random：the normal control，LPS stimulation，Huayuqutan，Buqi，Huayu，Qutan recipes and normal serum control groups.Then the mRNA expressions of TLR4，NF-κB and TNF-α were tested by real-time PCR.Content of TNF-α was detected by ELISA，while protein expressions of TLR4 and NF-κB were tested by Western-blot method.Results The expressions of TLR4，NF-κB and TNF-α were increased compared to normal group after stimulation of LPS(P ＜0.01).The expressions of TLR4，NF-κB and TNF-α in Huayuqutan recipe group and Huayu recipe group were obviously inhibited compared to LPS stimulation group(P＜0.01).Conclusions The molecular mechanism of Huayulutan recipe and Huayu recipe against AS is probably to inhibit the activation of TLR4/NF-κB signal pathway.

Huayuqutan recipe;Atherosclerosis;Inflammation signal pathway

R285.5

A

1005-9202(2012)23-5159-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.028

國家自然科學基金青年基金項目(81202834);中國博士后科學基金項目(No.201104611);遼寧省高等學校杰出青年學者成長計劃資助項目(LJQ20111100);沈陽市科技局計劃項目(F12-277-1-49)

1 沈陽市第六人民醫(yī)院

楊關林(1962-)，男，教授，博士后合作導師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病研究。

賈連群(1975-)，女，副教授，在讀博士后，主要從事中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化分子機制研究。

〔2011-10-28收稿 2012-03-10修回〕

(編輯 曹夢園)