王旭光 張 忠 吳麗華 郭 麗 吳 璠 阿 良 李 想(沈陽醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 0034)

幽門螺桿菌對(duì)腸化生胃黏膜GST-π和p53表達(dá)的影響

王旭光 張 忠 吳麗華 郭 麗 吳 璠 阿 良1李 想(沈陽醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110034)

目的 探討幽門螺桿菌(HP)對(duì)腸化生胃黏膜GST-π和p53表達(dá)的影響。方法 采用免疫組化染色檢測30例正常胃黏膜、182例腸化生胃黏膜和32例胃癌組織GST-π和p53蛋白表達(dá)狀況;采用HE染色和ELISA方法判斷HP感染。結(jié)果 HP陽性腸化生組GST-π表達(dá)陽性率顯著高于正常胃黏膜和胃癌組(P＜0.01)，顯著低于HP陰性腸化生組(P＜0.01)。HP陽性腸化生組p53蛋白表達(dá)陽性率顯著高于正常胃黏膜和HP陰性者，顯著低于胃癌組(P＜0.01)。HP陽性腸化生經(jīng)HP根除治療后，其GST-π表達(dá)陽性率高于根除治療前(P＜0.05)，p53蛋白表達(dá)陽性率低于根除治療前(P＜0.01)。結(jié)論 HP感染可能通過降低GST-π表達(dá)、削弱GST-π的保護(hù)性作用和增強(qiáng)突變型p53基因的表達(dá)增強(qiáng)而在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。早期進(jìn)行HP根除治療，對(duì)于降低胃癌發(fā)生具有現(xiàn)實(shí)意義。

幽門螺桿菌;腸化生;π類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶;p53

近年來，大量的流行病學(xué)資料顯示，幽門螺桿菌(HP)感染與胃黏膜腸上皮化生(IM)和胃癌有密切的關(guān)系，但HP感染如何導(dǎo)致IM乃至胃癌發(fā)生仍不清楚。π類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST-π)是人體內(nèi)重要的保護(hù)性物質(zhì)，具有解毒和抗癌作用〔1〕。野生型p53基因是目前研究最廣泛的抑癌基因，突變型p53表現(xiàn)為癌基因的作用，是人類腫瘤晚期的重要分子事件〔2〕。相關(guān)IM的發(fā)生發(fā)展中GST-π和p53發(fā)揮著什么樣的作用，尚不清楚。本研究擬探討HP相關(guān)性IM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象及分組

所有胃黏膜組織和血清樣品均來自2000～2005年中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院、遼寧省腫瘤醫(yī)院和沈陽醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院。經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，研究對(duì)象包括正常對(duì)照組30例，IM組182例和胃癌組32例。上述各組性別及年齡構(gòu)成上均無顯著差異，胃癌患者均為初治。

1.2 方法

1.2.1 血清的采集 采血前1 d晚禁食、水、吸煙。抽取受檢者5 ml空腹外周靜脈血，室溫靜置 1 h，2 400 r/min離心10 min，吸取血清分裝后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 胃黏膜活檢組織的收集 用胃鏡分別于胃竇、胃角和胃體部取活檢組織，經(jīng)95%酒精或10%中性甲醛固定。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色 梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5 μm。常規(guī)HE染色，進(jìn)行病理診斷和HP觀察。HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察HP的感染情況，胃黏膜表面黏液層及小凹上皮內(nèi)見少量單曲或S型彎曲狀的桿狀細(xì)菌者為HP陽性(+)，中等量者為?，大量者為?。

1.2.4 ELISA檢測血清HP IgG抗體 按試劑盒操作(試劑盒購于Biohit plc，芬蘭)，450 nm波長下測量吸光度，百德軟件處理，得出血清HP IgG抗體濃度值。

1.2.5 HP感染判定 以HP組織學(xué)觀察和血清HP IgG抗體檢測結(jié)果綜合判定HP感染狀況。符合以下三種情況之一者判定為陽性：(1)血清HP IgG抗體≥44單位者判為陽性;(2)組織學(xué)檢測HP?及以上者判為陽性;(3)血清HP IgG抗體介于32～44單位之間，且組織學(xué)檢測HP+者，判為陽性。據(jù)此，腸化生組分為HP陽性組86例和HP陰性組96例。組間性別及年齡構(gòu)成無顯著差異。

1.2.6 HP根除治療 對(duì)HP陽性者給予有機(jī)鉍劑(胃敏膠囊)、甲硝唑、羥氨芐青霉素三聯(lián)藥物治療，3個(gè)月治療結(jié)束，停藥4 w后，復(fù)查胃鏡HP仍保持陰性者判為HP根除。經(jīng)上述方法判定，HP根除者45例，HP未根除者41例。

1.2.7 免疫組織化學(xué)(SP)法檢測GST-π和p53蛋白表達(dá)按試劑盒說明操作。磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對(duì)照，已知陽性片作陽性對(duì)照。GST-π和p53蛋白即用型一抗均購于福州邁新。

1.2.8 結(jié)果判定 GST-π以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性。陰性：無棕色反應(yīng);陽性：淡黃色(只染色個(gè)別腺體或個(gè)別細(xì)胞)或棕黃色(彌漫在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其分布范圍較廣泛呈多灶性)或棕色(出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面及腺腔內(nèi)，分布廣泛)。p53蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色著色判定為陽性。陰性：整張切片無一個(gè)陽性細(xì)胞;陽性：陽性細(xì)胞數(shù)＞1%以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HP感染對(duì)IM胃黏膜GST-π和P53蛋白表達(dá)的影響

正常胃黏膜組織中未見GST-π表達(dá);IM胃黏膜GST-π呈散在表達(dá)，陽性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)分布在刷狀緣和細(xì)胞核;胃癌組織中GST-π呈片狀彌漫強(qiáng)陽性著色。86例HP陽性IM胃黏膜組GST-π表達(dá)陽性率為55.8%(48例)，顯著高于正常胃黏膜組(0%)，顯著低于 HP陰性 IM組〔76例(79.2%)〕(P＜0.01)，與胃癌組〔14例(43.8%)〕相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;HP陰性IM胃黏膜組GST-π表達(dá)陽性率顯著高于正常胃黏膜組和胃癌組(P＜0.01)，胃癌組的GST-π表達(dá)陽性率顯著高于正常胃黏膜組(P＜0.01)。正常胃黏膜組織中未見p53蛋白表達(dá);IM胃黏膜、胃癌組織中p53蛋白均呈陽性表達(dá)，陽性產(chǎn)物主要局限于胃黏膜上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞核內(nèi)。HP陽性IM組p53蛋白表達(dá)陽性率〔38例(44.2%)〕顯著高于正常胃黏膜組(0%)和HP陰性IM組〔9例(9.4%)〕，顯著低于胃癌組〔24例(75.0%)〕(P＜0.01);HP陰性IM組p53蛋白表達(dá)陽性率與正常胃黏膜組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胃癌組的p53蛋白表達(dá)陽性率顯著高于正常胃黏膜組和HP陰性IM組(P＜0.01)。見圖1。

2.2 HP根除治療前后IM胃黏膜GST-π和P53蛋白表達(dá)的變化

根除治療后HP仍為陽性者41例，HP轉(zhuǎn)陰45例。HP轉(zhuǎn)陰的45例IM胃黏膜中36例(80.0%)GST-π呈陽性表達(dá)，顯著高于根除治療前(55.6%)(P ＜0.05)，與HP陰性IM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HP轉(zhuǎn)陰的45例中8例(17.8%)p53蛋白表達(dá)陽性，顯著低于根除治療前(44.4%)(P＜0.01)，與HP陰性IM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根除治療后，HP未根除組GST-π和p53蛋白表達(dá)陽性率分別為58.6%和39.0%，與根除治療前比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 IM胃黏膜組織GST-π、p53陽性表達(dá)(SP)

3 討論

野生型p53基因具有引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡和促進(jìn)分化的腫瘤抑制基因的作用。而突變型p53基因則表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞增殖的癌基因的作用。研究顯示，野生型p53蛋白的半衰期較短，一般僅為2 min;突變型p53蛋白因構(gòu)型的變化更加穩(wěn)定，半衰期可明顯延長至1.47 h，故可通過免疫組化技術(shù)加以檢測，提示突變型p53基因的存在〔3〕。

GSTs是人體內(nèi)重要的Ⅱ相解毒酶，主要功能是參與經(jīng)由食物和藥物等進(jìn)入人體的有毒物質(zhì)的代謝，催化谷胱甘肽與親核物質(zhì)(有毒物質(zhì)、烷化劑、蒽環(huán)類抗腫瘤藥物)結(jié)合，并以硫醚氨酸結(jié)合物這種無毒物質(zhì)的形式從尿中排出，或代謝為無毒性的醇類物質(zhì)。因此，GSTs是人體內(nèi)重要的保護(hù)性物質(zhì)。依同工酶等電點(diǎn)的不同，GSTs分為堿性α類、中性μ類和酸性π類，其中 GST-π 與腫瘤密切相關(guān)〔4～6〕。

作為內(nèi)在的重要保護(hù)性因素，無論是p53基因還是GST-π，勢必都會(huì)在機(jī)體遭受外在因素?fù)p害后發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用，進(jìn)而引起某些量或質(zhì)的變化。本研究結(jié)果提示，在胃癌形成前，從正常胃黏膜到發(fā)生IM，GST-π作為保護(hù)性物質(zhì)已被激活;隨著機(jī)體損傷和病變的加重，GST-π的保護(hù)作用開始減弱甚至喪失，胃癌即可能發(fā)生。目前關(guān)于GST-π的激活機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為，可能是GST-π活性部位的關(guān)鍵殘基第47位的半胱氨酸和第162位的組氨酸被激活〔7〕。進(jìn)一步的分析顯示，HP感染可使GST-π表達(dá)降低，并可通過降低機(jī)體的保護(hù)作用而使胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)相對(duì)增加。由于HP的菌體蛋白可激發(fā)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放自由基，后者具有強(qiáng)大的破壞作用，可使核酸主鏈斷裂，堿基降解和氫鍵破壞，形成直接致癌或促癌作用〔8，9〕。GST-π具有類似谷胱甘肽過氧化酶的抗氧化作用，能通過酶蛋白自身的氧化(SH基氧化成-S-S-)清除活性氧或自由基〔5〕。因此，當(dāng)GST-π的保護(hù)作用無法抵抗HP的致毒作用時(shí)，即表現(xiàn)出表達(dá)降低。

本研究結(jié)果提示，HP感染可促進(jìn)突變型p53基因的表達(dá)增強(qiáng)，并可始于Correa的“正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌”這一胃癌發(fā)生模式中的較早階段IM。HP感染后可導(dǎo)致胃黏膜一氧化氮合成酶增多、氧自由基釋放〔10〕，進(jìn)而引起 DNA 損傷，p53 基因突變〔11〕。隨著p53基因突變量和表達(dá)量的積累以及其他致癌因素的共同作用，細(xì)胞可以無限生長，細(xì)胞凋亡減少或不凋亡〔12〕，最終導(dǎo)致胃癌發(fā)生。

綜上，筆者推測HP感染可能通過促使GST-π表達(dá)降低、削弱GST-π的保護(hù)性作用和促進(jìn)突變型p53基因的表達(dá)增強(qiáng)而在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。預(yù)防HP感染，早期進(jìn)行HP根除治療，對(duì)于降低胃癌發(fā)生具有現(xiàn)實(shí)意義。

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R57

A

1005-9202(2012)23-5142-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.019

1 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院

王旭光(1971-)，女，博士，副教授，主要從事胃癌癌前病變研究。

〔2012-08-06收稿 2012-10-08修回〕

(編輯 袁左鳴)